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1、一、引言自1873年推导出衍射极限以来，光学显微镜的分辨率在接下来的一个多世纪中未能取得根本性突破。然而，对于高分辨率的追求从来就没有停止。最终，经过不懈努力，科学家在20世纪90年代取得突破。由于衍射极限的存在，可见光波段范围内的显微镜分辨率一直被限制在250nm以内。超分辨显微术的出现使得人类终于打破这一桎梏。得益于过去20年超分辨显微术的进步,现阶段己经可以实现在Xy平面和沿Z轴将分辨率分别提升610倍。需要强调的是，超分辨显微术并非特指某项技术，而是若干种不同技术方案的总称。但是,无论具体实现方式如何，这些技术在本质上是相通的：各种技术都由光强调制，并且非线性地开关荧光染料分子以实现对
2、荧光辐射的操控,继而在时间上依次记录整个观察区域内的细节。正是由于这些技术能够提供突破衍射极限的分辨率，才使首次使用光学显微镜进行许多生命科学研究成为可能。由于大部分生物结构都具备三维空间分布，因此，将超分辨率成像扩展至三维水平，可以清晰地显示这些生物体结构或记录分子运动。将原有的二维超分辨显微成像扩展至三维水平有多种技术实现路径。对于单分子定位显微术（SM1.M）,如光激活定位显微术（PA1.M）、随机光学重构显微术、荧光激活定位显微术（fPA1.M）而言，可以采用双焦面成像或者点扩散函数（PSF）操控的方法；对于以受激发射损耗显微术（STED）,可逆饱和光学荧光跃迁显微术为代表的目标开关超
3、分辨显微术而言，最常用的策略则是同时使用两个相位板，通过非相干叠加的方式来创造一个三维中空的STED/RESO1.FT聚焦光斑。通过以上两种技术路径都可以在理论上获得无限小的分辨率。然而，在这些不受衍射极限限制的技术中，光的衍射现象实质上仍然发挥作用。然而，无论使用哪种技术，最终能达的分辨率仍然取决于显微镜聚焦光斑的锐利程度。这一事实导致的后果便是：相对而言，轴向分辨率的提高比横向（焦平面内）分辨率的提高更加困难。因此，即使通过超分辨显微术可以将横向分辨率提升到20-40nm,但是同一架构下达到的轴向分辨率仍然比横向分辨率低（后者约是前者的2.5倍）。相对而言，各向同性的三维分辨率受到更多青睐
4、；因为各向同性的三维分辨率能够提供更加自然的视野，并且基于这样的图像进行数据分析，得到的结果也更加精确。然而，由于使用单个透镜只能覆盖半个球面波波前，除非刻意牺牲横向分辨率，否则要做到三维各向同性是非常困难的。另外,如果存在一个光学系统,能够收集焦面之后的另外半个球面波波前，由于对称性的恢匏，系统PSF的形状就可以（基本上）保持为一个球形。基于上述思想，在20世纪90年代早期，Hell等发明了基于两个对置物镜的4Pi显微镜。在实际应用中，一个物镜大约只可以覆盖65。的半孔径角，使用两个物镜则可以几乎完整覆盖整个4几的立体角（实际应该为2.53Ji）。如图1所示，在4Pi显微术中，逆向传播的两束
5、相干照明光分别经过两个对置物镜在共焦面上聚焦，并产生叠加干涉条纹的PSF。这种实现方式被称为A型4Pi架构。另一种实现方式，即B型4Pi架构，则通过对置物镜反向收集荧光信号并让它们在探测器上发生干涉。由于引入了共焦面附近的干涉，上述两种方式都可以在轴向上显著压缩PSF的尺寸一一这也是构成扫描型4Pi显微镜的基础。如果只保证激发光（A型4Pi架构）或荧光（B型4Pi架构）相干，则可以将轴向分辨率提高34倍。如果同时使激发光和荧光相干（C型4Pi架构），则可以将轴向分辨率提高约7倍。除此之外，由于4Pi架构可以从两个方向收集荧光，可收集的荧光光子数可翻倍，最终可以提高图像的信噪比（SNR）。与之类
6、似,非相干干涉照明图像干涉显微术可以被理解为是4Pi显微术基于相机的宽视场版本:包含两个对置物镜，在焦面附近采用驻波干涉作为照明，并以相干的方式收集荧光信号:因此，它的分辨率也与4Pi显微镜类似。图1.4Pi显微镜的简化架构与原理示意图。（八）简化架构示意图。(b)在轴向平面(XZ平面)内的4Pi显微镜PSF。上卜,两个物镜的PSF相干叠加压缩了整个PSF的轴向尺寸。(C)不同4Pi架构的有效PSF。从左至右：A型架构，激发光相干；B型架构，发射光(荧光)相干；C型架构，两者同时相干。APD：雪期光电二极管：BS：50/50分光镜；DM：二向色镜；1.：透镜：M：反射镜：SM：扫描镜。4Pi显
7、微术与超分辨显微术的结合可以进一步提高系统的三维分辨率，特别是轴向分辨率。与单物镜版本的超分辨显微术类似,4Pi超分辨显微术也可以分为目标开关型(isoSTED、4Pi-RESO1.FT)和随机开关型(iPA1.M、4Pi-SMS.4Pi-SM1.M)两类，如图2（八）所示。在目标开关型4Pi超分辨显微术中，分别来自对置物镜逆向传播的两个波前发生干涉相消，使得STED/RESO1.FT聚焦光斑的中央光强极小值区域在轴向得到显著压缩图2(b)因此，荧光信号的发射被限制在焦点附近非常小的区域内。而4Pi-RES01.FT和isoSTED技术的主要区别在于前者主要使用具有可逆开关效应的荧光蛋白(RS
8、FP)来提供超分辨显微术所需要的亮态和暗态。对于随机开关型的4Pi超分辨显微术，轴向分辨率的提高则主要利用算法提取险藏在干涉条纹中的轴向（Z方向）位置信息图2（b）为了求解位置信息，对于不同的设计可以同时记录三幅（iPA1.M）或四幅（4Pi-SMS、4Pi-SM1.M）干涉相位图。STED,=FlUOrMOnc.STED.,FlorMCnc,Extatonlaser图24Pi超分辨显微术的简化架构和原理示意图。（八）isoSTED4Pi-RESO1.FT（左）与4Pi-SM1.M（右）显微镜的简化架构示意图。两种架构在成像时都将样品放置在物镜共焦面上。围绕光路的小图标显示出在光路不同位置（由
9、带圈I-Xl号标出）光的偏振态。特别地，在位置VII、V川和Xl处，同一幅图中的虚线箭头相对于实线箭头有”2的相位延迟，该延迟是由系统中的石英楔造成的。左图：在isoSTED4Pi-RESO1.FT显微镜中，两束STED光，即STED*y（横向）和STED,（轴向）互不相干并保持垂直的偏振态。两束光通过一个偏振分光棱镜（PBS）合束后，再经过一组扫描镜进入4Pi干涉腔。合束后的光经第二个PBS分束后,在物镜的共焦点位置分别生成STEay（横向）和STEDZ（轴向）损耗光聚焦光斑如图（b）从左起第一和第二列所示。两个光斑的中央光强极小值（即焦点）位置互相重合，并通过受激发射对荧光发射现象产生各向
10、同性的损耗作用如图（b）从左起第三列所示。这种作用是通过迫使被STED光照射的荧光分子持续性地处于暗态的方式发挥效用的。同时，焦点附近的荧光信号被两个物镜反向收集。收集到的荧光光子在一片二向色镜上发生反射，并最终进入探测器。右图：在4Pi-SM1.M显微镜中，荧光光束被一组分束器反复分束和合束，以形成一系列具有不同干涉相位的光波波前。这些光波波前的相互干涉图样最终被位于干涉腔之后的相机同时接收。虽然在不同的设计中，具体的光路和探测器的数量不同，但所使用的单分子定位原理都是相通的，即经过干涉条纹调制后的PSF相比原有的PSF含有更多的高频信息，因此利用4Pi-PSF进行定位计算，所得到的结果可以
11、更加精确。（b）4Pi超分辨显微镜中的PSF轴向平面（XZ平面）强度剖视图。从左至右：isoSTED4Pi-RESoIFT显微镜中的STEDXy、STED合并后的STED（红色），以及有效PSF（绿色）：4Pi-SMlM显微镜中相对相位差。=0、90。、270。、180。时的荧光干涉PSF。为了更准确地描述isoSTED4Pi-RESO1.FT显微镜及4Pi-SM1.M显微镜的各种PSF,在相应图片的右上角给出了在探测器（APD或相机）上测得的横向平面（焦平面，即Xy平面）内的荧光强度分布。GW：玻璃窗口；HWP：半波片：Q：石英楔；VP：02n涡旋相位板；5/p:S偏振光/p偏振光。下面将详
12、细讨论4Pi超分辨显微术的两种架构和它们的具体应用。需要强调的是，图像干涉非相干结构光照明干涉显微术（imageinterferenceandincoherent-illumination-interferencestructuredilluminationmicroscopy,I5S）并不在本文的讨论范畴。与I5M相比，I5S显微术在横向上利用结构光照明，实现了对有效PSF的三维压缩。但是，从原理上讲，I5S显微术并不依赖任何荧光的开关效应，即该技术既不需要目标开关也不需要随机开关。这使得I5S几乎可与任何荧光分子兼容，因此在具体应用上会拥有相当的优势。然而，也正因为如此，在理论上，I5S相
13、对于宽视场显微术也仅能将分辨率提高两倍。为了进一步提高分辨率，则需要在显微镜中引入诸如荧光饱和的各种荧光非线性效应。但是遗憾的是，基于荧光饱和的I5S（或称为“I5SS”）至今仍未实现。STED超分辨显微术是基于1994年提出的理论模型发展起来的。该技术首先于1999年被实现并被用于材料学研究，并随即在2000年实现了在生命科学领域的应用。自此，STED彻底改变了荧光成像的范式。STED是首个被实现的基于目标开关原理的超分辨显微术。其基本工作原理是,在某一确定位置.，通过荧光发射损耗效应将荧光发射限制在其周围一个亚衍射极限的区域内。当工作时，一个光强最强点位于中心的激发光斑和一个环形的STED
14、光斑相互嵌套并扫描样品上的整个成像区域，在此期间，通过一个与焦点共短的点探测器顺次读取信号并生成最终的图像。为了提高STED显微术的分辨率，STED光斑中心点之外的荧光发射都必须得到有效损耗。因此，一个高质量、中央光强为零的环形光斑对于提升STED显微镜的表现显得尤为重要。过去15年的技术进步已经使STED显微术迈进了三维成像的新纪元。在众多具体的实现方法中，基于两个对置物镜的4Pi架构，由于可以在轴向生成非常锐利的STED聚焦暗斑而尤为引人注目。虽然其分辨率优势没有得到充分的发挥，但是早期的所谓STED-4Pi显微术已经能够在焦平面附近提供约33nm的轴向分辨率。而作为其改良版本的isoST
15、ED显微术则己能提供各向同性的三维高分辨率图像图2（八）为了实现各向同性的三维荧光压缩,isoSTED显微术同时使用了两个光强零点重合的STED聚焦光斑:其中一个用于横向(STEDXy)压缩，而另一个则用于轴向(STED2)压缩，如图2(b)所示。通过对两个聚焦光斑的光强分配进行调节，可以实现PSF大小(即分辨率)的精细操控。其中，为了生成STEDZ聚焦光斑，需要将分别来自于两个对置物镜、相向传播的光波波前在焦平面上完美重合并形成干涉相消。由于单物镜PSF中的光强和相位对于焦平面高度对称，干涉相消除了在焦面中央产生一个光强零点外，在焦面上下都会产生一系列周期性分布的光强零点。这些次级光强零点会
16、与激发光和探测光（荧光）PSF相重合。由于在这些次级光强零点附近，STED光没有荧光发射损耗能力，进而造成荧光信号泄漏，最终产生了有效PSF中的旁瓣，并造成使图像质量明显恶化的轴向“鬼影（ghostimages）现象。更为严重的是，当使用这样的有效PSF扫描整个样品时，由于上下光路光程差的存在，PSF中的光强极大值点会在PSF的包络下产生轴向飘移。因此，任何试图使用一成不变的PSF进行反卷积运算以消除旁瓣的努力都是徒劳的。理论上，基于可变PSF的反卷积运算可能会减轻“鬼影现象，但是该方法仅适用于可以精确估计PSF并且图像信噪比很高的场合（这在现实中都很难做到）。为了消除有效PSF中旁瓣的影响，一种有效的策略是加入离焦量，使两个物镜的聚焦光斑产生反向偏移，从而破坏STEDZ聚焦光斑中的对称性。这个策略可以通过使用相位板添加附加相位的方法实现。虽然类似的效果也可以通过直接调节两个对置物镜间的距离，从而破坏二者的共焦性的方式实现,但是使用相位板不会造
