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1、一、引言根据抗体协会（AntibodySociety）的名单,截至2021年9月，有127种抗体在美国和欧盟上市。其中，超过一半（77/127）以膜蛋白为靶标。然而，这些抗体中的大多数都是靶向具有简单跨膜区和较长胞外区（ECD）的膜蛋白，如酪氨酸激酶受体。仅有三种靶向结构复杂的膜蛋白，如G蛋白偶联受体（GPCR）o值得注意的是，获批药物中约40%通过靶向GPCR复合物发挥药理作用，体现了膜蛋白类治疗性抗体的开发潜力。事实上，离子通道、转运蛋白、GPCR和激酶是药物研发中最大的一类药物靶点。业界和相关研究团队已有多篇关于膜蛋白抗体的优秀综述。本文主要探讨治疗性抗体研发现状和技术革新，以致力于研发
2、和识别更复杂的膜蛋白抗体，包括GPCR、离子通道、转运蛋白和激酶。GPCR和离子通道是小分子化合物重要的作用靶点。分析2016年美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物靶标发现，GPCR和离子通道在小分子治疗药物中分别占比33%和18%oGPCR和离子通道是生物医药研究和临床研发高度关注的热点。如何选择膜蛋白靶点是小分子药物开发中遇到的一个关键问题，虽然小分子比抗体更容易到达作用部位，但抗体能有效识别复杂膜蛋白的胞外区。以CC趋化因子受体4（CCR4）为例，该基因编码的蛋白属于GPCR家族，CCR4抗体mogamulizumab批准用于治疗复发或难治性簟样真菌病和S6zary综合征。另一个例
3、子是预防偏头痛的药物erenumab,其抑制了降钙素基因相关肽受体（CGRPR）的生物活性。靶向膜蛋白的抗体制备策略之一是抗体工程化改造。当特定蛋白构象改变与疾病状况相关时，抗体药物在选择性、特异性和效应功能方面具有许多额外的优势，单克隆抗体BI1.Olot靶向非功能性的胞外ATP激活离子通道无功能的噂吟受体P2X7(nfP2X7),目前正在利用该抗体进行治疗基底细胞癌的临床试验。抗体偶联药物通过改善药代动力学增加了药物活性，Gptx-I多肽毒素偶联抗体在有效阻断Navl.7离子通道的同时延长了抗体半衰期，并能更好地作用于神经纤维。除了直接作用外，抗体还可以通过抗体依赖的细胞毒(ADCC)和补
4、体依赖的细胞毒(CDC)等效应发挥功能。利用mogamulizumab证明了可通过改造抗体可结晶片段(Fc)区来提高药效和安全性。蛋白质晶体技术和其他结构生物学手段有助于我们更好地解析膜蛋白的三维结构。模拟膜蛋白天然结构制备环状多肽抗原，从而成功研发靶向这些蛋白的治疗性抗体。抗体的分离纯化也得益于技术进步，大肠杆菌GroE1.作为分子佐剂进行DNA免疫，诱导了针对靶向蛋白的特异性抗原，提高DNA免疫在体内激发抗体产生的效率。膜蛋白靶向抗体药物的发展经历了四个关键技术。第一是分离稳定天然蛋白构象的抗原；第二是克服免疫耐受，即免疫系统对类似自身抗原结构不产生免疫应答;第三个关键点则需要考虑这些靶分
5、子多样化的胞外区(抗体的作用区域)；第四是筛选有效作用于膜蛋白功能位点的特定抗体。不同的研发策略以及新技术和新方法正被用于解决上述关键技术以开发更高效的抗体药物。表1列出了正在进行临床前研究和已用于临床治疗的膜蛋白靶点抗体药物。我们根据靶点类型、抗原结构、抗体形式和抗体生产平台将这些抗体进行分类，并给出配体、结合位点、作用机制、有效性、表位、治疗适应症和副作用等详细信息（表1）。表I靶向膜蛋白抗体研发的关键技术及面临的挑战TargetTargetclassAntibodydrugCompanyAntigenformatAntibodyformatIndicationReferencesCCR4
6、GPCRMofnulizu11ub/PoteligeoKyowaHakkoKirinPuri11edhMermirulpeptideHununizedglyco-MiginecrcdIgGIMycosisFungoidesorSezarysyndrome18-20CCR5CPCRPRO140/1.cronlimdbCytoDyn1.1.2-CCR5*cellsHununizedversionofmurinemAbCVHD.HIV.triplenegativebreastcancer21-24CCRPRGPCRErenumab/AimovigAmgen/NovartisSolubleN*term
7、irulECDexpressedinHEK293cellsHununlgG2Migraineprevention125-29C5aRGPCRIPH54OIInnatePhJnlUMedlmmune1.1.C1.12cellsoverexpressingC5aRGCancer301.GR5CPCRBNC-IOIBionomicsNAHumanizedmonoclonalantibodyMecastariccolorectalcancerRHCPCRMC1.A-158(alsotargetingEGFR)McrusNAFabsfromcombinatoriallibrariesofrearrang
8、edhypcrvariab!cVmandV1sequencesfromnonimmunizedhumandonorsColorectalcancer32G1.P-ICPCRJY09BeijinDonnjBiotechCo.1.td.NAConstructionwithhu11unlgG2FcfragmentandpeptidemonistDtabecesorobesity33CBICPCRNinucinubBirdRockBioNANAFttMosisameubolicandinflammatorydiseasesMCXCR4CPCRUlocuplumabBristobMycrsSquibbC
9、ellsOvcrcxpressingCXCR4HumanG4monoclonalMultiplemyelomaR5Omi-IQlciumreleaseactivatedchannelAmgenNovoNocdiskCellsoverexpressingOmI-IExiraceIIuUrlp2peptideXenoMouyeproducedhumanantibodiesHumanizedmurineantibodiesAutoimmunedisease13637nfP2X71.igandgatedionchannelBI1.OIOtBioscepcrePeptideofregionuniquel
10、yexposedinthisvariantofP2X7(nfP2X7)gcCancer121Glucosetransporterinward-openoroutward-openstatesTransporter1.N043.1.M048IntegralMoiccularVirusdikcparticlesIgGI-RDiabetes38MMP-14ProteaseMembraneboundenzyme3A2UCRiversideandSBPMedicalDiscoveryInstituteQtalyticdomainofMMP-MFabfromsynthesizedhumanFablibra
11、ryCancer39HumanapelinreceptorGPCRJN241-9AmgcnStabilizedtargetproteininnanodiscsSingk-domainantibodydc11vPubMed数据库和抗体协会的相关资料给出了目前处于临床前和临床开发中的膜蛋白靶向抗体，本文挑选了其中具有代表性的例子，探讨了靶向膜蛋白抗体的作用机制、膜蛋白抗原的制备以及抗体的研制。二、膜蛋白抗体的作用机制GPCR的胞外区介导受体与配体相互作用，激活的受体将信号传递到细胞内并招募下游效应蛋白。离子通道在细胞膜上形成一个孔道，疏水性氨基酸面向磷脂双层，离子可以通过这个通道穿过细胞膜的疏水核
12、心。离子通道、GPCR和其他跨膜蛋白参与了许多重要的细胞生物学效应，其功能异常与多种疾病有关。因此，以它们为靶点开发的抗体在治疗和预防相关疾病方面有独特的优势。研发膜蛋白治疗性抗体的几个要素：结构高度保守是机体维持正常功能不可或缺的，因此针对这些靶点的干预手段具有更广的选择性；跨膜蛋白（离子通道，GPCR）和膜结合的激酶（基质金属蛋白酶）的结构多样性，为干预调节这些蛋白的特定功能提供了许多思路，更易于研发靶向特异性的治疗抗体；通过多种方式优化改造抗体自身复杂的结构可设计出针对多靶点的单抗药物。膜蛋白抗体与GPCR的结构及可能的互作位点如图1（八）所示。单抗与GPCR相互作用的一种方式是维持其活
13、性状态。一项关于GPR56的研究利用激发型抗体阐明了GPCR信号对人脑胶质瘤发生、发展的作用。另外一种效果是单抗促进GPCR形成二聚体功能单元，研究人员发现代谢型谷氨酸受体7和l肾上腺素能受体通过识别二聚体可有效激活GPCRo相对地，阻断型抗体可作为一种GPCR抑制剂，GlP是葡萄糖依赖性促胰岛素多肽，通过干预GIP-GIPR这一路径，有望治疗肥胖症和糖尿病患者。Mogamulizumab是靶向CCR4的人源化单克隆抗体,2018年被批准用于治疗淋巴瘤、SGary综合征和簟样真菌病，但未表现出显著的促进或抑制GPCR活性效应。MogamUIiZUmab通过清除肿瘤微环境中表达CCR4的肿瘤细胞
14、以及肿瘤浸润的调节性T细胞发挥作用，通过FC去岩藻糖基化加强了ADCC效应。靶向GPCR的单抗erenumab是一种降钙素基因相关肽(CGRP)抑制剂，结合和拮抗降钙素基因相关肽受体(CGRPR),2018年己被批准用于预防成人偏头痛。离子通道系列抗体的效应途径如图1(b)所示；抗体诱导细胞表面受体产生内化，钙释放激活钙通道调节分子1(Orai-I)与自身免疫炎性疾病相关，Orai-I蛋白形成了细胞膜钙离子通道，导致细胞外钙离子内流。钙离子信号传导对于T细胞活化和功能是必需的。针对结构复杂的膜蛋白靶点开发的单克隆抗体能够识别特殊构象图1(c),葡萄糖转运蛋白(G1.UT4)单抗分为向内开放和向外开放的构象状态，对葡萄糖的摄取和代谢至关重要。抗体作用于膜结合激酶，通过改变重链长CDR-H3区域，到达配体结合位点以催化目标蛋白酶图1(d)。具有超长CDR-H3的抗体来源于免疫骆驼血清，或人工合成的CDR-H3类似结构。基质金属蛋白酶-14(MMP-14)就是一个长CDR-H3靶向作用的膜蛋白位点。人apelin受体(APJ)是慢性心力衰竭患者的治疗靶点。靶向apelin受体的抗体川241-9属于A类GPCR,其N末端胞外区比B类GPCR更短。骆驼单域抗体突变体JN
