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1、ICSDB62甘肃省地方标准DB62T-X-2022玉米顶腐病检验鉴定技术规程（征求意见稿）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施甘肃省市场监督管理局发布前言1 .范围12 .规范性引用文件13 .术语与定义14 .原理15 .试剂与材料16 .仪器与用具27 .取样方法28 .田间症状鉴定29 .检验方法310 .结果判定411 .样品保存与处理4附录A培养基配方及制作方法5附录B玉米顶腐病菌菌体形态特征6本文件按照GBT1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则规定起草。本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。本文件由甘肃省粮油作物栽培标准化技术委员会归口
2、。本文件主要起草单位：河西学院本文件参与起草单位：甘肃前进生物科技发展有限公司、甘肃省农业信息中心、高台县农业技术服务中心、临泽县农业技术推广中心、张掖国家级玉米种子生产基地种子质量监督检验中心、张掖市建国作物种质创新育种工作室、酒泉市通盈种苗有限公司本文件主要起草人：雷玉明、马金、张婿、郑天翔、公晓佳、刘晓刚、孙志、马丽娟、濮超、李自峰、李涛、杨国振、石建国、张琪本文件由河西学院负责解释。各单位或个人在执行本文件过程中如发现需要修改和补充之处，请随时将意见和建议反馈至玉米顶腐病检验鉴定技术规程编制组（地址：甘肃省张掖市甘州区北环路846号河西学院，邮政编码：734000,E-mail:Zyy
3、mlei,联系电话:13993672655）玉米顶腐病检验鉴定技术规程1 .范围本文件规定了玉米顶腐病检验取样方法、田间症状识别、实验室检验、结果判断及样品保存与处理的技术要求。本文件适用于玉米制种亲本材料、杂交种玉米顶腐病的检验和鉴定。2 .规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本标准。本文件中未引用相关标准文本。3 .术语与定义以下术语与定义适用于本文件。3 .1亚粘团镰抱霉一种引起玉米顶腐病的真菌，属半知菌亚门、丝抱纲、丛梗抱目、痛座抱科、镰抱霉属的一种真菌
4、。3.2 菌落筛选需要从分离培养基培养生长出的大量菌落中，根据菌落形状、颜色、大小、菌丝形态等的各种特征，从中挑选出具有明显表型特征的目标菌落的过程。3.3 转接在无菌条件下，将目标菌落转移到适宜其生长的人工合成培养基而形成单一菌株的过程。4 .原理玉米顶腐病是一种土壤、种子传播的真菌性病害，其病原菌亚粘团镰泡霉主要在土壤、病残体、种子中越冬。玉米植株叶片、叶鞘、茎秆、果穗表现症状特征是玉米顶腐病田间诊断的初步依据；采用PSA培养基，从不同的带菌材料中分离出亚粘团镰抱霉根据病原菌形态特征最终进行玉米顶腐病鉴定。5 .试剂与材料5.10.1%升汞HgCl2称取升汞0.1g,用少许酒精溶解，再加蒸
5、储水至IOOmLO5.2乳酚油将苯酚结晶加热熔化后取20mL加入20mL乳酸中搅拌均匀，再先后加入20%甘油40mL和蒸馅水20mL搅拌均匀。5. 3硫酸链霉素C2IH41N7Oi6S6. 4蔗糖C12H22O117. 5琼脂Agar8. 6马铃薯potato9. 仪器及用具天平、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、微量移液器、移液器、离心机、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载玻片、盖玻片、吸管等。10. 样方法10.1 子取样每个品种随机选取100粒种子，放入新种子袋，填写完整的取样标签，送实验室检验。7. 2组织取样8. 2.1叶片、叶鞘取样出苗期至抽穗前、抽穗后，进行田间调查，发现具有玉米顶腐
6、病疑似叶片，取新鲜整个叶片、叶鞘，放入保鲜塑料袋或乳酚油的标本瓶中，送入实验室检验。9. 2.2根系取样玉米16叶期，进行田间调查，挖下玉米顶腐病疑似植株，将发病根系剪下，放入保鲜塑料袋或乳酚油的标本瓶中，送入实验室检验。10. 2.3茎杆取样玉米抽穗前后，进行田间调查，取穗位节或穗位节以下玉米顶腐病疑似茎杆，放入保鲜塑料袋或乳酚油的标木瓶中，送入实验室检验。11. 3土壤取样12. 3.1定点取样对具有玉米顶腐病典型症状或疑似症状的植株，直接取植株根部周围0.2d0.3/范围内、5cm深的表土，四分法制样后，取土样约500g送实验室检验。7. 3.2随机取样对玉米顶腐病发生田块进行整田病原调
7、查时，对角线5点取样，每点在2/范围内取5cm深的表土约IOOOg,将各点土样混和后，四分法制样，取土样约50Og送实验室检验。8田间症状鉴定8. 1畸形或枯死苗型出苗期，植株生长缓慢，叶片边缘失绿，出现黄色条斑，叶片皱缩、扭曲，叶缘出现“刀切状”缺刻，严重时幼苗基部变灰、变黄、变黑而形成枯死苗8. 2叶缘缺刻型玉米抽穗前，玉米植株上部叶片基部或边缘出现缺刻状，其上下叶缘呈黄亮色条斑，严重时12个叶片的沿中脉半边或全叶脱落，仅剩中脉及中脉上残留的少量叶肉组织。13. 3断叶状或枯死型玉米抽穗前,玉米植株上部叶片尖端呈黄褐色斑块,有时撕裂或呈断叶状,严重时顶端45叶尖端或全叶枯死。8.4扭曲卷裹
8、型玉米抽穗前，玉米植株顶端叶片扭曲卷缩呈鞭状直立或倾斜，有的形成鞭状时将新抽叶片卷裹不能伸展形成弓状，或缩成一团,缠结的叶片撕裂、皱缩。8.5弯头型玉米抽穗前，穗位节叶基和叶鞘发病变黄，叶基部缺刻状或撕裂，茎秆组织变黄软化，并向一侧倾斜，形成弯头。8.6顶叶丛生型玉米抽穗前，玉米植株顶端叶片丛生、直立。8.7叶片基部腐烂抽穗后，在穗位节上下叶片边缘产生灰褐色腐烂，并逐步向中脉扩展，叶基部出现不均匀褪绿，严重时叶肉全部腐烂或脱落，只留中脉。8.8叶鞘、茎秆腐烂抽穗后，穗位节叶片基部变褐色腐烂的常在叶鞘和茎秆髓部也出现腐烂，鞘内侧和紧靠茎秆皮层呈铁锈色腐烂，剖开茎部，部维管束和茎节出现淡褐色或红褐
9、色病点或呈片状腐烂,重时从树干基部至硬位节呈黑褐色腐烂，的茎秆中空，内生灰白色霉状物，风时容易折倒。8.9空秆畸形型抽穗后，玉米植株生长低矮、扭曲。雌、雄穗败育畸形或空秆，叶皱缩扭曲，抽穗结实,雌穗短小，籽少而不实。9检验方法9.1种子检验9.1.1吸水纸检验法将测定的玉米品种的种子先用蒸储水冲洗2次,链霉素消毒，无菌水冲洗2次,然后,将种子放入垫有三层消毒吸水纸的90mm或120mm玻璃培养皿内，每皿放入10粒，每个品种测定10粒种子。重复4次，然后将种子放在2425C恒温箱内培养8dIOd,最后,用体视显微镜和高倍显微镜相结合观察种子上真菌菌落生长习性及形态特点。9.L2培养基检验法将玉米
10、种子在70%酒精中浸15s20s,然后移入0.1%升汞液中杀菌0.5minImin,再用无菌水冲洗3次。将经表面杀菌的玉米籽粒置于盛有PSA平板上，每皿摆放10粒，每一品种重复3次。于25C1C温箱中培养4d5d,当种子周围长出菌丝体或种子表面有紫色霉层时，将菌丝或霉层移入PSA培养基上进行纯化培养，待长出子实体后进行真菌鉴定。PSA培养基配方及制作方法见附录A9.1.3菌落筛选和转接检查培养5d后的平板，若出现紫红菌落，将其转接至PDA培养基上，并在25C1C黑暗培养4d5d。9.L4病原菌鉴定观察微菌落的形成情况，并挑取种子周围菌体、PSA平板上的培养物进行显微镜检查，根据附录B描述的病原
11、菌形态特征进行鉴定。9.2组织检验9.2.1制样选取有典型症状的植株材料，叶片、叶鞘材料取病健交界处组织，切成大小为O.lcm0.2CmX(Mem-0.2cm见方的组织块；根、茎杆材料直接切取维管束变色部分组织每个长约0.5cm。9.2.2病原菌分离培养将取得的植物组织置于PSA培养基平板上，每个平板放置10个，每个样品设3个重复。平板置于25C1C黑暗培养5d,若组织周围出现紫红色菌落，将其转接至PSA培养基上获纯培养物，以备鉴定。9.2.3菌落筛选和转接方法同9.1.3。9.2.3病原菌鉴定方法同9.1.4。9.3土壤检验9.3.1制样取待检土壤每个样IOOg放入50OnlI烧杯中，加入I
12、OOml无菌水，充分搅拌Imin,静止30s。取上层悬浮液备用。9.3.2病原菌分离培养取200l壤悬浮液滴加于PSA培养基平板上，用接种棒涂抹均匀，每个样品设3个重复。平板置于25七1黑喑培养IOcL9.3.3菌落筛选和转接方法同9.1.3。9.3.4病原鉴定方法同9.1.4。10结果判定符合8中规定任何一种症状，且显微镜下观察其形态特征，符合附录B描述的亚粘团镰胞霉形态特征，培养物为引起玉米顶腐的病原菌，判断样品为玉米顶腐病。11样品保存与处理完成检验后，样品和分离物制成斜面试验菌种低温保存，制成浸渍标本或玻片标本，并妥善保存。使用的材料和用具，在使用完毕后进行煮沸、焚烧等消毒除害处理。附
13、录:附录A（规范性附录）培养基配方及制作方法A. PSA培养基配方及制作方法A.1配方马铃薯200g,蔗糖IOg20g,琼脂17g20g,硫酸链霉素，水IoOOm1。A.2制作方法将洗净去皮的马铃薯切碎，加水IOOOml煮沸约20min30min,用纱布滤去马铃薯，加水补足1000ml：加入蔗糖和琼胶，加热使琼脂完全熔化后，分装，12OC125C高压灭菌30mio附录B（规范性附录）玉米顶腐病菌菌体形态特征8.1 PSA培养基菌落特征B.1.1菌落形态气生菌丝绒毛状至粉末状。8. L2菌落颜色菌落2d3d为粉白，4d5d渐变为淡紫色，中部淡紫色，背面菌落淡黄色，边缘略呈淡紫色。8. 2产胞方式
14、产胞细胞内壁芽生，单、复瓶梗式产抱，以单瓶梗居多。8. 3小型分生抱子特征8. 3.1形状特征小型分生抱子长椭圆形或拟纺锤形，较小，呈假头状不呈串珠状着生。8. 3.2大小大小5.7m13.5m2.3m5.1m,无隔或1隔。8. 4大型分生胞子特征8. 4.1形状特征镰刀形，较直而细长，脚胞足跟不十分明显，顶端渐尖。B. 4.2大小具25隔，以3隔居多。2隔者平均18.9m3.9m;3隔33.1mx4.8mM隔48.9mx4.9m;5隔52.7m5.3moB.5生物学特性B.5.1温度菌丝生长的适宜温度为2（C25C,分生小抱子和大抱子的萌发适宜温度均为2530CB.5.2PH菌丝生长的最适p
15、H512,抱子萌发的最适pH79,产生抱子的最适pH680B.5.3光照光照处理菌丝生长的无影响，12h光+12h黑暗交替条件下产狗量最大；连续光照条件下抱子萌发率100%。玉米顶腐病检验鉴定技术规程地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源2019年12月25日，由河西学院申请制定地方标准的立项，根据甘肃省粮食与栽培作物标准委员会推荐的地方标准制订，甘肃省市场监督管理局批准第4批甘肃省地方标准制定计划要求，计划制定编号2019-4098,标准名称：玉米顶腐病检验鉴定技术规程。（二）起草单位及参与人员主要起草单位：河西学院本文件参与起草单位：甘肃前进生物科技发展有限公司、甘肃省农业信息中心、高台县农业技术服务中心、临泽县农业技术推广中心
