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1、klf2、klf4预料内毒素所致急性肺损伤大鼠的探讨K1.F2、K1.F4预料内毒素所致急性肺损伤大鼠的探讨【摘要】目的探讨Krppel样转录因子K1.F2、K1.E4在内毒素诱导大鼠急性肺损伤时的动态表达，分析两者与急性肺损伤的相关性。方法将100只SD大鼠随机(随机数字法)分为健康比照组和模型组，模型组进一步随机分成3组。模型组采纳尾静脉注射1.PS(5mgkg)复制A1.l模型，分别于尾静脉注射后2、4、24h后采血及肺组织。视察各组病理表现、RT-PCR检测K1.F2mRNA.K1.E4mRNA在血清中及肺组织的表达，分析K1.F2、K1.F4在急性肺损伤中的动态表达,采纳SPSS17
2、.0软件进行统计学分析。结果病理显示造模后4h肺损伤最为明显，K1.F2mRNA、K1.F4mRNA在正常大鼠肺组织及血清中均有明显发达，模型组各组KU：2、K1.F4的表达较比照组显著减弱(P0.01),其中K1.F2mRN在2h表达明显低于4h组和24h组(P0.01),K1.F4mKNA在4h表达明显低于2h组和24h组(PO.01)o结论K1.E2在大鼠急性肺损伤表达变更早于病理变更，K1.F4具有同步性：K1.F2、K1.F4可作为急性肺损伤早期诊断的分子标记物.【关键词】K1.E2；K1.F4；急性肺损伤：内毒素；早期诊断StudytherolesofK1.F2,K1.F4inpr
3、edictionofacutelunginjuryinratsinducedbyendotoxinYangYongShenYoukui,Dong1.iwen,1.ouZhengqing,WangJun,FuXiaoqing.DepartmentofCardiothoracicSurgeryGuangxinAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310007,ChinaCorrespondingauthor：ShenYoukui,Email：ShenyOUkUiAbstractObjectiveToinvestig
4、atetheexpressionsofK1.F2mRNandK1.F4mRNAintheacutelunginjury(A1.I)ratsinducedbylipopolysaccharide(1.PS),andtoanalyzethecorrelationbetweenK1.2,K1.F4andA1.1.MethodsAtotalof100SDratswererandomlydividedinto2groups：normalcontrolgroupand1.PStreatedgroup,thenthelattergroupwasrandomlyfurtherdividedinto3subgr
5、oupsaspertheserumandlungtissuesamplestakenseparatelyat2,4and24haftermodeling.The1.Imodelwasmadebyinjecting5mgkg1.PSintotailvein.Thepathologicalchangesoflungtissuewereobservedineachgroup,andtheexpressionsofK1.F2,K1.F4mRNAinserumandlungtissueweredetectedbyRT-PCR.Thedataoflaboratoryfindingswereanalyzed
6、withSPSS17.0softwareforstatisticalanalysis.ResultsThehistopathologicalchangesshowedthemostobviousdamageoflungtissueoccurredat4hoursaftermodeling.TheexpressionsofK1.F2mRNandK1.F4InRNAinthelungtissueandserumofcontrolgroupweresignificantlyhighercomparedto1.PStreatedsubgroups(PKeywordsK1.F2；K1.F4：Acutel
7、unginjury；Endotoxin；Earlydiagnosis急性肺损伤(acutelunginjury,A1.I)是源于干脆或间接的急性进行性肺泡毛细血管膜的炎症性损伤，临床表现为顽固性低氧血症、进行性加重的呼吸困难和非心源性肺水肿等，随着病情发展进一步转变为急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS),RDS是临床中发病率和病死率都很高的一种疾病。目前临床上主要依据其病理生理变更和临床表现，实行综合性治疗措施口-4,但其发病率和病死率仍居高不下。因此预防和治疗此疾病在临床中具有重要的意义。K1.F2,K1.F4是锌指Krppel样转
8、录因子家族成员之一，近年来探讨发觉K1.F2,KlPl在很多肺部疾病中呈现出不同的表达状况，在很多肺部疾病的发病中可能具有关键作用。本试验试图通过视察急性肺损伤大鼠血清及肺组织中K1.F2,K1.F4的动态表达，探讨其早期诊断急性肺损伤的可行性。1材料与方法1.1动物健康成年SD大鼠100只，雌雄不拘，体质量(25020)g,由浙江中医药高校试验动物中心供应。1.2主要仪器与试剂脂多糖(1.PS,Escherichiacoli0127:B8,1.3129,Sigma,美国)：RM-80呼吸频率监测器（美国Columbus公司），ABI7500实时荧光PCR仪（美国ABI公司），TotalRNE
9、xtractionReagent（Trizol）购Fl杭州硕盟生物，ReverTraAceqPCRRTkit购自TOYOBo公司，Bcstar-RcalTimePCRMasterMix（SYBRGreen染料法）购自德国DBlBioscience公司。1.3试验分组依据前期探讨结合文献5-6报道，将100只SD大鼠随机（随机数字法）分为正常比照组（A组，n=10）和模型组（n=90）,其中模型组被进一步随机分成三组：B组（造模2h,最初阶段，A1.l形成，n=30）,C组（造模4h、1.I高峰组，n=30）,和D组（造模24h,A1.I减轻组，n=30）o1.4模型复制采纳尾静脉注射1.PS复
10、制A1.l模型，剂量均为5mgkg比照组尾静脓注射1m1.生理盐水。用2.5%戊巴比妥（2m1.kg）在大鼠腹腔注射麻醉后开胸；心脏取血制备血清，分别后置于-80C冰箱保存待检：取右肺上叶制作肺组织匀浆，-80C冰箱保存待检；取右下叶肺组织立刻备检，用于肺湿/干质量比测定：取左下叶肺组织以10与甲醛固定24h,用于病理组织检查。1.5呼吸频率的测定处死大鼠前用呼吸频率监测器测定大鼠的呼吸频率。1.6肺组织含水量测定取右下叶肺组织，滤纸吸干表面水分，置于干燥称量纸上称得湖质量（W）,置70C恒温箱，烘烤至恒重后称量干质量（D）,以湿重干质量（WD）比值表示肺组织含水量。1.7肺脏组织学视察取左下
11、叶肺放入10%甲醛溶液固定，常规HE染色后光镜下视察。任选10个视野从五项指标进行肺损伤评分，累加各项评分取其平均值作为A1.I的病理评分，见表Io1. 8K1.F2mRNA的表达测定采纳SYBRGreen染料法相对定量PCR对肺组织及血清分别进行检测。选用3-磷酸甘油使脱氢酶（GAPDH）为内参基因，采纳PrimerExpress2.0和Beacondesigner软件进行荧光引物的设计,然后由浙江高校分子生物试验室负责合成，序列如表2。1. 9统计学方法试验结果均以均数标准差（xs）表示，以SPSS17.0软件进行分析。多组间比较采纳OnefayANOVA方差分析，组间差异采纳1.SD检验
12、方法。以PO.05为差异具有统计学意义。2结果2.1一般状况变更试验前各组动物在静息状态下呼吸平稳，频率为60次min左右,试验组在注入脂多糖后渐渐出现呼吸急促、烦躁，2h左右出现呼吸窘迫状，轻度发纲，呼吸频率增加，4h后发期明显，频率100次min左右。24h时大鼠无明显发细，呼吸频率仍较快。统计显示B、C、I）组较组呼吸频率均明显增加，差异具有统计学意义（PO.01）,C组呼吸频率较B、D组明显增加，差异具有统计学意义（P0.01）,见表32. 2肺组织含水量变更模型各组湿干比重较比照组均有明显增加，差异具有统计学意义（P001）,C组肺组织湿干比重较B、D组明显增加，差异具有统计学意义（
13、P005）,见表3。2. 3肺组织病理变更健康比照组：肺组织结构清楚、肺泡壁薄且光滑，肺泡间隔匀称一样：B组:肺泡腔轻度变窄，部分肺泡壁增厚，肺充血，肺间质轻度水肿，小灶状炎细胞浸润：C组：肺泡腔变窄或消逝，腔内可见炎细胞明显增多，肺泡壁明显增厚，肺充血，肺间质水肿，炎细胞充满性浸润。D组：肺泡腔变窄，腔内可见炎细胞浸润，肺泡壁增厚，肺充血，肺间质水肿，灶状炎细胞浸涧，见图UB、C、D组较A组病理学评分均明显增加1,差异具有统计学意义（PO.01）,C组病理学评分较B、D组亦明显增加，差异具有统计学意义（P0.01）,见表2o2. 4K1.F2、K1.F4mRN的表达2.4.1组织及血清中K1
14、.F2mRNA结果B、C、D组组织及血清中K1.F2mRN的表达水平明显低于比照组，差异具有统计学意义（P2.4.2组织及血清中K1.FlmRN结果B、C、D组组织及血清中K1.FImRNA的表达水平明显低于比照组，其中B,C组与A组比较差异具有统计学意义(P001),D组与A组比较差异具有统计学意义(P0.05)；C组K1.F4mRA的表达水平最低，与B、D组比较，差异具有统计学意义(P0.01)见表4。3探讨急性肺损伤(A1.I)的发生和发展涉及到多种病理生理过程，包括炎症反应、氧化应激和凋亡等。其中炎症反应与氧化应激被认为是A1.l星期最主要病理生理机制4,7。探讨发觉A1.I在细胞水平
15、上表现为中性粒细胞(PMN),肺巨噬细胞(AV)等炎性细胞的浸润与激活，及血管内皮细胞(EC)的损伤：在分子水平上则表现为肿瘤坏死因子(NF-B)的活化及众多促炎因子、黏附分子及趋化因子等的过度表达，并伴有多种炎性介质的产生，炎性介质所形成的炎性级联反应导致肺组织广泛损伤。探讨表明，A1.I时PMN在肺内大量聚集激活，释放白介素T(I1.T)、肿痛坏死因子(TNF-)等多种介质加重肺损伤8,从动物模型证明，假如去除肺内中性粒细胞的聚集，肺损伤程度会大大减轻9T0：AM的激活通常是肺部炎胜反应发生的导火索。激活的AM可致NF-B的过度活化、肺I1.-I和TNF-等的合成和释放11：肺血管EC既是
16、受损的主要靶细胞，更是活跃的炎性反应和效应细胞，I1.-I和TNF-等可激活血管EC,使其上调表达ICAv-I等黏附分子。黏附分子通过影响炎性介质、炎性细胞等向肺泡迁移即黏附于肺泡或血管EC的强度而调整A1.I的进程。同时由巨噬细胞和中性粒细胞在急性炎症过程中的大量激活和呼吸爆发觉象导致了大量的氧臼由基的产生12,H由基可引起生物细胞膜、蛋白质和DNA等的干脆和间接的损伤。K1.F2、K1.Fl为Krppel样转录因子子家族中的成员,K1.Fs广泛参加细胞增殖、凋亡，以及胚胎发育等多个生命活动的调控13-15。最近的探讨表明转录因子K1.F2、K1.F4在炎症反应、转化应激等方面发挥着重要的作
