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1、RNA干扰缄默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响RNA干扰缄默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响【摘要】目的：探讨RNA干扰缄默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法：体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体,1.ipofectamin2000介导转染膀胱癌EJ细胞，采纳RTPCR和WesternBlot方法检测特异性ShRNAXjEZH2基因缄默效果，转染后采纳MTT法检测ShRNA对细胞增殖的作用：应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的变更.结果：EZH2基因的ShRNA表达载体有效卜调EZH2基因的表达(Pit;0.05).与比照组比较,细胞增殖明显抑制(Pi
2、t;0.此)：同时引起细胞Gl期阻滞，RNA干扰后，Gl期细胞增加(84.08.7)%vs(52.06.8)%,Pit：0.05,S期细胞削减(11.01.1)%vs(43.04.9)%,Pit;0.05.结论：EZH2基因有望成为应用RNAi技术探究膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.【关键词】膀胱肿痛EZH2基因RNA干扰细胞增殖细胞周期0引言EZH2基因(enhancerofzesthomolog2,EZH2)是多梳基因家族(PolyCombgrOup,PCG)的主要成员，与果蝇zeste基因增强子是同源基因.在胚胎发育早期普遍存在，其高表达可促进细胞增殖，并参加肿揄的发生发展1.有探讨2显示，
3、EZH2基因在膈胱癌组织表达增加，与浸润转移亲密相关，但作用机制还不明确.木探讨以EZH2基因为靶点，设计构建其短发夹状RNA的表达载体并转染膀胱癌EJ细胞，视察EZH2基因对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响并探讨其作用机制，为膀胱癌基因治疗供应试验基础.1材料和方法1.1材料人膀胱癌EJ细胞由天津泌尿外科探讨所保存.1.ipofectaminc2000RNA提取纯化试剂TRIZol（美国Invitrogen公司）：RTPCR试剂盒，质粒DNA提取试剂盒（北京博大泰克生物制品公司）；抗人EZH2多克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）.1.2方法1. 2.1EZH2基
4、因ShRNA表达载体的构建依据文献3的方法，选择EZH2InRNA的461481bp之间的核昔酸序列Aagactctgaatgcagttgct为RNA干扰的靶序列，体外合成两端带有BamHI和HindIII粘端酶切位点，内含5AGACTCTGAATGCAGTTGCTTTCAGAGAAGCACTGC11CAGAGTCTT3发夹状序列的双链DNA,将合成的片段接入PRNAT载体，转染DH5大肠杆菌，筛选、扩增，经测序证明构建胜利，称之为EZH2shRNA：同时构建阴性表达质粒，称之为EZH2scrambled.1.2.2重组质粒转染复苏的膀胱癌EJ细胞置事先加含100ml.1.胎牛血清的RPMI1
5、640培育基的100mm培育皿中，37C,50m1./1.C02孵箱内培育，常规更换培育液、传代.试验用细胞均使之处于状态良好的对数生长期.转染前1d按试验要求将所需密度的细胞接种6孔培育板，待细胞达到所需融合率时在无血清的DMEM环境中转染，操作步骤按1.ipofectamin2000说明书进行.试验分为：转染EZH2ShRNA质粒为RNA干扰组：转染EZH2scrambled为阴性质粒组；未转染的EJ细胞为比照组.1.2. 3RTPCR检测EJ细胞EZH2基因mRN表达转染后48h后，收集各试验组口细胞约1107,提取细胞总RNA.取5g总RNA,加入11.由16个脱氧胸昔酸碱基组成的寡核
6、甘酸Oligo(Dt)16,按说明书操作合成cDNA的第一链，然后进行PCR反应.GAPDH为内参照.引物的序列为EZH2(289bp):上游：5 GTGGAGAGATTATTTCTCAAGATG3,下游：6 CCGCTCTTCGGGCTCGCC3;GAPDH弓I物(492bp):上游：5TGAAGGTCGGTGTGAACGGAmGG3,下游：5CATGTAGGCCtgaggtccaccac3,反应条件为：95C预变性5min,94C变性50s,52C退火50s,72,C延长1min.各取101.反应产物，12g/1.琼脂糖凝胶电泳，TmageMasterTotal1.ab软件进行条带分析，以
7、EZH2与GAPDH条带的积分吸光度比值表示EZH2mRNA的表达变更.1.2.4WesternBlot检测EJ细胞EZH2基因蛋白表达抗体为1：1000稀释的EZH2抗兔人多克隆抗体，二抗为1:200稀释的生物素标记的羊抗兔多克隆抗体，DAB显色.SDSPAGE电泳、转膜采纳常规方法，actin作为内参照.检测EZH2蛋白和actin蛋白在各组表达条带的灰度值，两者灰度值的比值（EZH2/actin）反映EZH2蛋白的表达变更.1.2.5MTT法检测EJ细胞增殖细胞以5103/1001.接种96孔细胞板培育，待细胞融合率达50%70t时，分别转染EZH2shRNA,EZH2scrambled
8、质粒，同时设比照组和只加培育基的调零组，每组3个熨孔.转染后24,48,72,96和120h时每孔加入5g/1.的MTT151.,37C,50m!1.C02孵箱敷育4h,吸取上清后，每孔加入DMSO1501.,室温下振荡IOmin,酶标仪波长49Onm检测各孔A值，不同时间点依次检测，试验结果取3个熨孔的平均值，绘制细胞生长曲线，肿瘤细胞生长抑制率（%）=（I-试验组值/比照组A值）100眼1.2.6流式细胞仪检测细胞周期转染EZH2ShRNA的细胞和正常EJ细胞胰蛋白醉消化并收集细胞,1000r/min离心IOmin,收集细胞沉淀；PBS洗2次，用预冷的700m1./1.乙醇，-20过夜，以
9、PBS洗脱乙醉，加入PI染色液1m1.,室温30min,上流式细胞仪检测细胞周期变更，试验设3个复孔.统计学处理：采纳SPSSlO.0统计软件进行数据分析，组间比较采纳方差分析，组间多重比较采纳1.SD-t检验，Pit;0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1重组质粒鉴定重组质粒经双旃切鉴定，可见有大于6000bp的长片段和小于100bp的短片段，提取质粒上海康成公司测序，结果完全正确，干扰载体构建胜利（图1）.M：PCR标准分子质量；12:重组质粒.图1重组质粒双醉切的电泳结果（略）2.2EJ细胞EZH2基因11RNA表达RTPCR产物电泳结果显示RNA干扰组细胞EZH2基因mRN表达明显
10、降低EZH2mRNA与GAPDIImRNA灰度比值分别为：比照组：0.4860.070；阴性质粒组：0.2730.050；RNA干扰组：0.0230.003.RNAT扰组与比照组比较差异具有统计学意义（Pit;0.05）,而阴性质粒组与比照组比较无明显差异（Pgt;0.05,图2）.2.3EJ细胞EZH2基因蛋白表达WeSlCrnBIol结果显示EZH2蛋白与actin蛋白灰度比值分别是:比照组：0.4990.097：阴性质粒组：0.3810.050：RNA干扰组：0.1090.004.RNA干扰组与比照组比较差异有统计学意义（Pit;0.05）,而阴性质粒组与比照组比较无明显差异（Pgt;0
11、.05,图3）.M：PCR标准分子质量；1：比照组：2:RA干扰组；3:阴性质粒组.图2EZH2mRNA在试验各组表达（略）1：RNA干扰组；2:阴性质粒组；3:比照组.图3EZH2蛋白在试验各组表达（略）2.4MTT法比较EJ细胞增殖活性细胞增殖曲线显示，与比照组比较，RNA干扰组的EJ细胞其增殖速度明显降低，转染后24,48,72,96和120h,细胞生长抑制率分别为43.9%,59.1%,49%,45.5%和45.2%,以转染后48h最高，与比照组比较差异均有统计学意义(Pit;0.05),而阴性质粒组细胞生长变更与比照组比较无明显差异(Pgt;0.05,图4).图4MTT方法检测细胞增
12、殖状况(略)2.5流式细胞仪检测RNA干扰组Gl期细胞为(84.08.7)%,S期细胞为(11.01.1)%,而比照组Gl期细胞为(52.06.8)%,S期细胞为(43.04.9)%,两者相比较差异均有统计学意义(Pit；005,图5).3探讨肿瘤细胞的异样增殖与肿病的侵袭和转移亲密相关，这一病理过程涉及很多基因的参加.EZH2基因是新发觉的癌基因，在胚胎发育早期普遍存在，是维持细胞增殖所必需的，探讨发觉EZH2基因高表达的肿瘤组织增殖实力加强并与肿瘤侵袭转移亲密相关4-5,因此，作为一个新的分子标记物引起探讨者的广泛关注.本探讨我们发觉，靶向EZH2基因ShRNA转染膀胱癌EJ细胞后，细胞的
13、增殖实力明显下降，提示EZH2基因可能是膀胱癌基因治疗的一个新靶点.EZH2是一种转录抑制因子，其编码蛋白含有高度保守的SET结构域，该结构域具有甲基转移酶的活性，通过甲基化作用抑制下游基因的表达，其中大多为抑癌基因，结果导致在肿瘤侵袭转移过程中促进肿瘤转移和抑制肿瘤转移基因间的相互作用倾向于前者，促进了肿揄的增殖和转移6-7.RN干扰组：B：A：比照组.图5RNA干扰组和比照组细胞周期分布（略）细胞周期调控异样是恶性肿瘤增殖异样的主要缘由，肿瘤是多基因疾病，很多基因干脆或间接参加细胞周期调控，这些基因的突变或表达异样可以引起细胞周期的失控，使肿瘤细胞获得以细胞增殖为主的失控性生长特征8.有探
14、讨证明EZH2基因高表达可以抑制一些细胞周期相关基因的表达，促进细胞进入S期和G2M期转换3.我们的探讨也证明靶向EZH2基因ShRNA表达载体转染膀胱癌EJ细胞后，进入Gl期的EJ细胞明显增多，进入S期的细胞明显削减，EJ细胞出现Gl期阻滞.这表明通过RNA干扰下调EZH2基因表达后，抑制了肿瘤细胞恶性增殖信号转导，阻滞细胞周期进展，使细胞增殖实力下降MTT检测显示在转染后48h细胞增殖抑制率最高，我们推想一方面EZH2的表达是否有细胞周期依靠性，另一方面是否ShRNA载体的表达有时相性.综上所述，EZH2与肿痛的发生、发展亲密相关，而EZH2基因ShRNA表达载体可以阻挡细胞周期进展，抑制
15、肿痛细胞增殖，因此采纳RNAi来抑制EZH2基因的表达，阻挡肿瘤的生长，可能是肿痛基因治疗的有效途径，但如何高效的将ShRNA转染到肿瘤细胞以及提高ShRNA的器官靶向特异性是RNA干扰临床应用所必需解决的问题.【参考文献】1BachmannIM,Halvorsen0J,CollettK,etal.EZH2expressionisassociatedwithhighproliferalionrateandaggressivetumorsubgroupsincutaneousmelanomaandcancersoftheendometrium,prostate,andbreastJ.JClinOncol,2006,24(2):268-273.2张一兵，牛海涛，畅继武.EZH2基因在膀胱移行细胞癌组织的表达及其临床意义J.中国综合临床，2008,24(3):193-195.3BrackenP,PasiniD,CapraM,etal.EZH2isdownstreamofthepRBE2Fpathway,essentialforproliferationandamplifiedincancerJ.EMBOJ,2003,22(20):5323-5333.4宋力，崔小健，苏大军，等.前列腺癌组织EZH2基因的表达及其意义J.第四军医高校学报，2006,13：1193-1195.5Colle
