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1、SARS冠状病毒N基因的扩增与克隆栏目：论著基础探讨SAKS冠状病毒N基因的扩增与克隆作者：肖维威翼飞分子生物学探讨所，广东广州510515；州总医院分子肿瘤学探讨所，广东广州510010)1；马文丽1；吴清华1；张宝1；郑文岭1：王艳2(1；毛向明1第一军医高校2广州军区广1；彭1：宋艳斌摘要：目的RT-PCR扩增、克隆SARS冠状病毒N蛋白基因。方法依据GenBank数据库中TOR2株的全基因组序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物RTPCR巢式扩增SARS冠状病毒的N基因，PCR产物克隆后进行测序鉴定。结果序列分析表明，pMD18-T载体中已胜利重组了N基因。结论N蛋白基
2、因的扩增、克隆胜利，为N蛋白的表达、N蛋白结构与功能的探讨奠定了基础。关键词：严峻急性呼吸综合征；N基因，冠状病毒；逆转录聚合醉链反应中图分类号：Q786文献标识码：文章编号：1000-2588(2001)01-003903AmplificationandcloningoftheNgeneofSAKS-associatedcoronavirusXIOWei-wei1；MAWen-Iil；ZHANGBaol；WANGYanl;MAoKiang-ming1：PENGYi-feil；SONGYan-binl；WUQing-hual；ZHENGWcn-Iing2!InstituteofMolecula
3、rBiology,FirstMilitaryMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2InstituteofMolecularOncology,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouCommand,Guangzhou510010,ChinaAbstract:ObjectiveToamplifyandclonetheNgeneofsevereacuterespiratorysyndrome-associatedcoronavirus.MethodUsingprimcrPremier5.0software,twopairsof
4、nestedPCRprimersweredesignedtoamplifytheNgene.Afterpurification,theamplifiedproductswereclonedintopMD18Tvectors,andthepositivecloneswiththeinsertedfragmentswereidcntificdbysequenceanalysis.ResultsTheamplifiedproductswasabout1375bpinlength,andsequenceanalysisdemonstratedthattheNgenefragmentshadbeensu
5、ccessfullyinsertedintopMD18Tvectors.ConclusionThesuccessfulampificationandcloningofNgenefacilitatesfurtherinvestigationoftheexpressionoftheNproteinandstudyofitsstructureandfunctions.Keywords:severeacuterespiratorysyndrome;SRS:N-gene,coronavirus;reversetranscription-polymerasechainreaction收稿口期：2003-0
6、7-01作者介绍：肖维威（1974-）,女，1998年毕业于第一军医高校，现为第一军医高校在读博士探讨生，讲师，电话：020-61648114-89097通讯作者:马文丽，电话：020-61648210,E-mai1:wenlifimmu.ComCorrespondingauthor:MAWen-Ii,E-mai1:we11li2003年4月16,WHO正式确认SARS冠状病毒是SARS感染的病原体。生物信息学分析和病毒学探讨表明，SARS冠状病毒不属于任何已知的冠状病毒家系，是一类新型病毒12。SARS病毒颗粒四周环围着象日冕一样的圆环，圆环之上和外壳表面分布着大大小小的蛋白。但对感染致病起
7、重要作用的可能是6种关键蛋白：E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、多聚酶和3C1.蛋白水解酶。本探讨应用臼行设计的巢式引物RT-PCR扩增了其中的N基因，并对N基因进行了克隆和鉴定，现将试验结果报告如下。1材料与方法1.1材料样品取自北京SARS住院患者的痰液标本：受体菌TOPlO由本探讨所保存；PMD18-T载体、Rnase抑制剂、N6随机引物、PCR试剂及相对分子质量Mark-erDl,2000购自大连宝生物工程有限公司；逆转录酶SUPerSCriPtn购自Invitrogen公司。1.2方法1.2.1引物依据GenBank供应的SARS病毒T0R2株全基因组序列，利用生物学软件PrimerP
8、remier5.O自行设计犷增N基因的巢式引物（表1）。引物采纳本探讨所的ABl3900DNA合成仪合成。1.2.2病毒RNA提取样品加等体积水饱和酚混匀，65C加热Iomin后加1/2体积氯仿抽提1次,上清加1/10体积pH5.2的3mol/1.NaAc2倍体积无水乙醉沉淀，70%乙静漂洗后H然干燥，加适量DEPC水溶解。1.2.3逆转录加上述制备的RNA51,10mmol/1.dNTP51,Rnase抑制剂50U,N6随机引物20pmol,逆转录幅SuperscriptIl2.51,及DEPC水至501总体积。42反应1ho1.2.4PCR第1次PCR加上述cDNA反应液51,引物P1/P
9、2各10pmol,2PCR反应混合液（含PCR缓冲液、dNTP、Mg2+及TaqIW）101.加水至总体积201。94C预变性5min：94C变性30s,55C退火30s,72延长1min30s,循环30次。第2次PCR：取第1次PCR产物0.51做模板，用内侧引物P3/P4进行扩增，循环参数同前。1.2.5AT克隆将第2次的PCR产物用乙醉沉淀后，用101灭菌超纯水溶解。取纯化后PCR产物4.51,pMD18-T载体0.51,连接液51,混匀，16匕反应3h。连接产物转化宿主菌TOPlOo1.2.6PCR鉴定阳性克隆挑取白色菌落扩大培育后,用PMDI8-T载体引物（SOlOO5-CTAAAA
10、C-GACGGCCAGT-3,SOlOl5,-CGGCAGCTT-GC-3,）进行PCR鉴定。1.2.7测序挑取阳性克隆，经PCR鉴定后提取质粒测序。对测序结果进行Blast序列比较。2结果2.1RT-PCR扩增N基因的琼脂糖电泳分析应用外侧引物RT-PCR扩增SARS病人的临床样品，可视察到与我们设计相符的扩增条带约1900bpo以外侧引物的PCR产物为模板，接者用内侧引物犷增，得到含N基因约1375bp的特异性条带，基因片段大小与预期相符（图1）O图1RT-PCR电泳图Fig.1ResultsofRT-PCRM:MarkerD1.200;1.ane1:mpificationproductw
11、ithouterprimers;1.ane2:Secondamplificationwithinnerprimers2.2PCR鉴定阳性克隆内侧引物扩增的PCR产物用乙醉纯化后进行AT克隆。随机选择3个克隆应用载体引物S0100和SOlOl进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析可见到约140ObP的目的条带，初步证明重组质粒中含有N基因片段（图2）O图2克隆的PCR鉴定电泳图Fig.2PCRidentificationofthec1onesM:MarkerD1.200;1.anes1-3:Amplificationproductsoftherecombinantplasmidswiththevec
12、torprimers2.3N基因的序列分析将上述PCR鉴定的阳性克隆扩大培育后，提取质粒进行DNA序列分析。图3所示为部分N基因片段的测序结果。对结果进行B1.AST分析，与己公布的TOR2株的N蛋白基因序列一样，进一步证明N基因克隆胜利。3探讨N蛋白姑SARS冠状病毒中一种重要的结构蛋白，处于病毒颗粒的核心部分，以与病毒基因组RNA结合的形式存在，在病毒的包装过程中起着重要的作用。经B1.AST分析发觉，SARS病毒的N蛋白与鼠肝炎病毒的N蛋白同源性很高，含有其他冠状病毒N蛋白中不存在的一段核转移信号序列。探讨推想SARS病毒在侵入宿主细胞以后是通过这个核转移信号序列进入到细胞核中，并与宿主
13、DNA整合发挥其生物学作用45N蛋白中含有这段特别序列提示我们，对SARS病毒N蛋白的功能和其在SARS发病中的意义还须要更进一步的探讨。图3N基因的序列分析Fig.3ApartofDNAsequencemapoftheNgene目前，SARS的疫情已经得到限制，但SARS病毒的来源仍不明确，SARS的防治还未找到有效的方法。对SARS关键蛋白N蛋白的扩增、克隆胜利，为SARS病毒N蛋白的表达、蛋白结构与功能的探讨，以及进一步阐明SARS病毒致病机制、开展抗SARS药物筛选、制备快速检测SARS病毒的诊断试剂盒等探讨奠定了基础678三参考文献：lPeirisJ,1.aiS,Poon1.,eta
14、l.Coronavirusasapossiblecauseofse-vcreacuterespiratorysyndromeJ.1.ancet,2003,361(9366):1319-25.2KsiazekTG,ErdmanD,GoldsmithCS,etal.Anove1coronavirusassociatedwithsevereacuterespiratorysyndromeJ.NEnglJMed,2003,348(20):1953-66.3RotaPA,ObersteMS,MonroeSS,etal.Characterizationofanovelcoronavirusassociat
15、edwithsevereacuterespiratorysyndromeJ.Science,2003,300(5624):13949.4NelsonGW,StohlmanSA,TaharaSM.Highaffinityinteractionbe-tweennucleocapsidproteinand1eaderintergenicsequenceofmousehepatitisvirusRNAJ.JGenVirol,2000,81(Pt1):181-8.5ChenH,WurmT,BrittonP,etal.Interactionofthecoronavirusnu-cIeoproteinwithnucleolarantigensandthehostcellJ.JVirol,2002,76(10):5233-50.6王艳，马文明，宋艳彬，等.反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒J.第一军医高校学报，2003,23(5):421-3.WangY,MaW1.,SongYB,etal.GenesequenceanalysisofSARS-associatedcoronavirusbynestedRT-PCRJ.JFirstMilMedUniv/DIYiJunYiDaXueXueBao,2003,23(5):421-3.
