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1、SARSCoVN蛋白和MAP19的相互作用SARSCoVN蛋白和MAP19的相互作用【摘要】目的：探讨SARSCoVN蛋白与MAP19之间的相互作用。方法：利用免疫共沉淀试验验证SARSCoVN蛋白与MAPl9的相互作用，并利用Westernblot检测SARSCoVN蛋白对MAPI9表达量的影响。结果：SAKSC。VN蛋白与MAPI9能够在细胞内相互作用，且SRSCoVN能够显著提高MAP19的表达量。结论：SAKSCoVN蛋白与MAPl9能够在细胞内形成复合物，将为进一步探讨SARSCoVN蛋白与MAP19相互作用的生物学功能供应试验基础。【关键词】SARSCoVN：MP19;相互作用Ab
2、stractAIM:Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus(SRSCoV)istheetiologicalagentofSRS,anemergingdiseasecharacterizedbyatypicalpneumonia.UsingayeasttwohybridscreenwiththenucIeocapsid(N)proteinofSARSCoVasabait,theNproteinwasfoundtointeractwithMAB19,anonenzymaticproteinofMASP(mannanassociatedserineprot
3、ease).TheinteractionbetweenSARSCoVNandMAP19wouldbefurthertestedincelIsinthisarticle.METHODS:TheinteractionbetweenSARSCoVNandMAP19wasdemonstratedbyi11munocoprecipitation,andtheamountofMAP19influencedbySARSCoVNwasinvestgatedbyWesternblot.RESU1.TS:TheinteractionbetweenSRSCoVNandMAP19wasalreadydemonstra
4、tedbyimmunocoprccipitation.SRSCoVNgreatlyincreasedtheamountofMAP19.CONC1.USION:SARSCoVNcanbindwithMAP19incells.OurstudymaybeconductivetofurtherresearchintothemolecularmechanismofactionbetweenSARSCoVNandMAP19.KeywordslSARSCoVN:MP19;interactionSRS冠状病毒(SARSCoV)是SARS感染的元凶，以全长SARSCoVN蛋白为诱饵蛋白筛选人胎肝细胞cDN文库时
5、，发觉SARSCoVN蛋白可能与MAP19相互作用。SRSCoVN蛋白是SARS冠状病毒蛋白(SARSCoV)的结构蛋白，与病毒RNA结合形成核衣壳，是主要的抗原分子1,2MAP19是MASPs家族的成员，是MASP2的单一基因的选择性剪切产物3。MASPs可通过MBI.结合细菌或病毒表面的甘露糖残基结合而激活，MSP2可水解补体C4和C2,形成C3转化筋，是凝集素活化途径激活补体的重要的胸4。凝集素活化途径是补体系统活化的第三条途径，也是机体早期反抗病原微生物感染的一种防卫机制。MB1.途径缺乏在成人和儿童中可诱发各种感染性疾病。所以，一些病原微生物利用MB1.来入侵细胞5,6。本探讨利用免
6、疫共沉淀(IP)试验验证SRSCoVN蛋白与MAP19的相互作用，结果发觉SARSCoVN蛋白与MAP19能够在细胞内相互作用，且SARSCoVN能够显著提高MAP19的表达量，该结果为SARSCoVN在SARS致病机制的进一步探讨奠定了基础。1材料和方法1.1细胞培育293细胞均用含100m1./1.胎牛血清和100U/m1.青霉素、100U/m1.链霉素的DMEMdnvitrogen公司产品)在C02含量为50m1./1.的37C孵箱中培育，采纳消化法进行细胞传代。1.2质粒构建N基因(GcnBankaccessionnumberY274119)从患者血清的SRSCoVRN通过RTPCR获
7、得,(带EcoRI的上游引物，5Cggaattccatgtctgataatggaccc3：带BamHI的下游引物5GCGGTCCTTTGCCTGGTTGATC3)。扩增产物用PCR纯化试剂盒(ProInega)进行纯化，随后用EcoRI和BamllI的切，然后与经过同样根切的PEGFPCl载体(Clontech)连接，转化，测序。随后，N基因被克隆到pcDNA3Flag载体(Invitrogen),构建了pcDNA3FlagN表达质粒。MAP19基因片段缺失了5端22-56bp的DNA序列，我们实行的策略是利用PCR反应补全缺失的片段。补全MAP19基因片段所用引物：Pfl（49bp89bp）
8、（带BamIII的上游引物）5Cgggatccatgaggctgctgaccctcctgggccttc3；Pf2（35bp99bp）5CcctcctgggccttctgtgtggctcggtggccacccccttgggcccgaagtggccgGaacctgtg3；ph带ECoR的下游引物）：5cggttcctgggctctgctctg3。1. 3细胞培养与转染细胞转染采用VigOraS1.ipofectdnvitrogen,Inc.）转染试剂，严格根据转染试剂说明书进行操作。以100mm的培育皿为例，当培育皿中的细胞生长至覆盖60%80W11l底面积时进行转染。转染前1h将旧的培育基吸出，
9、加入4m1.含100m1./1.胎牛血清的DMEM完全培育基。然后配制质粒DN脂质体混合物：将10g质粒DNA（单一质粒或两种以上共转染质粒）与41.脂质体分别用2001.的150mmol/1.的NaCl稀释。室温放置5min后，将两者混合，稍微吹打混匀后室温放置15min,使DNA与脂质体形成复合物。取出待转染细胞，向培育皿中加入4001.的质粒DNA脂质体混合物，轻轻摇动培育皿，使DNA脂质体复合物匀称分布在培育皿中。在孵箱中培育68h后，将含有脂质体的培育基吸出，加入10m1.含血清和抗生素的完全培育基接着培育。换液36h后收集细胞。1. 4免疫共沉淀细胞转染36-48h后收集细胞。10
10、0mm的每皿细胞需加入6001.单去污剂裂解液(50mmol/1.Tris.Ch150mmol/1.NaCK10g/1.NP40以及蛋白酣抑制剂(RoChe,Inc)1片/25m1.)。当心吸取细胞裂解上清，加入10-151.抗Flag抗体(sigma)交联的琼脂糖珠，在4旋转孵育2h,进行免疫沉淀反应。2h后，IP产物用2501.裂解液洗涤3次，向IP产物中加入401.ISDS凝胶上样缓冲液，100C水浴5min。取离心上清及51.蛋白质预染Markerdnvitrogen,Inc)进行SDSPAGE凝胶电泳，半干转移法转膜后，分别用Flag抗体(Sigma)和SARSCoVN抗体(本室保存
11、)进行Westernblot检测；最终用EC1.化学发光试剂(PekinEImCr)进行化学发光反应。1. 5SARSCoVN蛋白和MAP19的表达量分析将GFP标签融合的SRSCoVN质粒(GFPN)和Flag标签融合的MAP19质粒(FIagMAP19)在293细胞里共表达，同时，用GFP空质粒与lagMP19共转染293T细胞(作为比照)。36h后裂解细胞，细胞裂解物用抗Flag抗体进行免疫沉淀反应，免疫沉淀物经SDSPAGE凝胶电泳后转膜，并用抗Flag抗体进行免疫印迹检测。在试验过程中，为了保证每份样品的蛋白浓度一样，采纳BioRadProteinAssay法对每份样品的裂解上清进行
12、总蛋臼定量，并用抗actin抗体进行检测以检查细胞内组成蛋白actin的量是否一样。2结果2.1拼接MAPI9全长基因由于从文库中筛选得到的MAP19基因片段缺失了AMAP19的N端编码第127城基酸DNA序列，我们实行的策略是利用PCR方法干脆合成缺失的N端片段(图D,连接到载体，测序表明正确。2. 2SRSCoVN蛋白与MAP19具有相互作用为了证明在哺乳动物细胞中两种蛋白可形成复合物，我们采纳带Flag标签的质粒MP19(FlagMP19)和带GFP标签的SRSCoVN蛋白(GFPN)质粒共转染293细胞。在DMEM培育基中培育36h后裂解，通过15000g离心制备细胞裂解物。细胞裂解物
13、用抗Flag抗体进行免疫沉淀反应，免疫沉淀物经SDSPAGE凝胶电泳后转膜，并用抗SARSCoV蛋臼抗体进行免疫印迹检测(图2)结果发觉，抗Flag抗体的IP产物中能够检测到GFP的存在，而作为阴性比照的鼠IgG免疫沉淀物中则检测不到GFPN的存在。说明FlagMP19可特异性地与GFPN共沉淀，形成豆合物；同时，用Flag空载体与GFPN质粒共转染293细胞时，抗Flag免疫沉淀产物中也检测不到GFPN,从而进一步证明了免疫共沉淀反应的特异性。2.3SRSCoVN蛋白显著提高MAP19的表达水平进一步地，我们探讨了SARSCoVN蛋白是否影响MAP19的表达水平，我们将GFP标签融合的SRS
14、CoVN质粒(GFPN)和Flag标签融合的MAPI9质粒(FIagMAP19)在293细胞里共表达，同时.，用GFP空质粒与FlagMAP19共转染293T细胞(作为比照)。36h后裂解细胞，细胞裂解物用抗Flag抗体进行免疫沉淀反应，免疫沉淀物经SDSPAGE凝胶电泳后转膜，并用抗Flag抗体进行免疫印迹检测。在试验过程中，为了保证每份样品的蛋白浓度一样，采纳BioRadProteinAssay法对每份样品的裂解上清进行总蛋白定量，并用抗actin抗体进行检测以检查细胞内组成蛋白actin的量是否一样。同时，我们用抗GFP抗体检测IP产物以及细胞裂解物中GFPN的存在，用鼠IgG(作为阴性
15、比照)进行免疫沉淀反应，用抗Flag抗体进行检测，结果检测不到FlagMAP19o结果，从抗Flag抗体的IP产物以及细胞裂解物中，可明显看到GFPN质粒和FlagMAP19质粒共转染293T细胞时，在细胞内组成蛋白actin的量相同的状况下，MAP19分子的表达量明显地高于比照组的表达量(图3).3探讨以全长SRSCoVN蛋白为诱饵蛋白筛选人胎肝细胞CDNA文库时，发觉SARSCoVN蛋白可能与MAP19相互作用。利用IP试验验证SARSCoVN蛋白与MAP19的相互作用，结果发觉SRSCoVN蛋白与MAP19能够在细胞内相互作用，且SRSCoVN蛋白能够显著提高MAP19的表达量。据文献报
16、道，SARS在第2周出现的病情恶化可能不是由无限制的病毒复制造成的，而更是由免疫病理损害造成的，可能与机体免疫防卫功能过度激活有关。最近的探讨发觉，SARS患者的肺损伤除了病毒造成的损伤以外，机体本身的免疫系统反应过于剧烈、免疫细胞释放的细胞或炎性因子过多造成的免疫病理也是一个主要缘由7。我们推想，VAPI9是MASPs家族的重要组成部分，MASPS能够参加补体的激活，因此SARSCoVN蛋白与MAP19相互作用,并显著提高MAP19的表达水平，可能从而导致MASPs的过度激活,过量的VASP2水解补体C4和C2,形成C3转化制,C3转化酶的过量积累从而造成了机体免疫防卫功能的过度激活。【参考文献】1贺福初SARS严峻急性
