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1、附录A伤塞、副伤寒实验诊断方法A.1痛原学榜测方法A.1.1标本采集A.1.1.1血液标本宜在病程的第1周第2周来集。成人无曲聚集静脉血5ml.-10m1.或按照血培养腌说明书采集全血进行全血培养：婴幼儿及儿杂采血量不应超过患者总血量的隔（一般3ml.-5ml.）.具体采血属参考血培养瓶说明书.已用抗生索者可直接全血做培养（使用有抗生素吸附剂的血培养瓶进行细雨培养）,血液凝固者可取血凝块搅碎后做培养。为提高检测阳性率，可使用双相血培养瓶手工或者自动化培养，双位点（无曲聚集病人两个位置静脓血双精培养（需氧+厌氧培笄.A.1.1.2粪便标本宜在精程的第3周第4冏米集患者新鲜兼使2g-3K或肛拭子立
2、即送检。如不能在2h内送检,可用卡里布莱尔（CarryBlair）运送保存培养基.在4C冷微条件下48h内送检.为提高培笄阳性率,也可视病人病程并结合端床症状（如第2周第3周）采集血液与炎使同时进行培养。A.1.1.3骨髓标本整个病程均可采集,已使用抗生素、其他标本培养阴性的疑似伤寒、副伤友.患音可做情髓培养。A.1.1.4尿液标本宜在病程的第1周第2周采集,留取中段尿Iom1.于无菌容器中及时送检.如不能在2h内送检，在4C冷斌条件下保存不超过8h.A.1.1.5胆汁标本利用十二指肠引流法或胆囊穿刺法或手术且接法无菌采集胆汁Iom1.,直接注入血培养精中，血培养胭于室温下尽快送检。A.1.2
3、分离培养A.1.2.1血液标本手工培养时，按1:1Oill入血液增储培养明或偏轴胆盐肉汤培养范，祝f36ClC的H.分别于Id,2d,7d转种血平板或营养琼脂平板，置36C1C培养24h48h.自动化培养时,仪器信号报警提示有细菌生长时,取培养瓶内增雨液接种于肌平板或营养琼脂平桢.温36C1C培养24h48h：自动化细阑培养时间一般为5d,对于已培养5d的阴性瓶，一般不需常规白传或终点转种，但临床诊断疑似伤塞感染者应常规声传或终点转种，谓免漏诊.A.1.2.2粪便标本取新鲜韭使标本宜接接种于沙门菌科玛嘉显色平板和麦康凯（MaC）琼脂平板上,K361C士1P培养18h-24h.直接接种同时应进行
4、增苗培笄.A.1.2.2.2增菌培养取新鲜炎使标本1g或肛拭子接种于9ml.亚硒酸乳的增菌培养基（SF）或者亚硒酸盐煌绿增苗培养基（SBG,说36ClC培笄18h-24h后，接种到沙门苗科玛嘉显色平板和MaC球丽平板上，祝36C1C培养18h-24IuA.1.2.3骨髓标本取骨储液做宜接分离或增苗分高培养，方法同血液标本,见Al.2.I.A,1.2.4尿液标本将中段尿窝心后取沉渣,加入7H.亚硒酸级钠增菌培养基（SF）或者亚硒酸盐煌绿增菌培养基（SBG）,趾36C1C培养I8h24h后，接种到沙门西科玛嘉显色平板上，置36匕1培养18h24h.A.1.2.5胆汁标本将胆汁注入血培葬瓶进行增菌分
5、离培养，方法同血液标本，见A1.2.1.A.1.3鉴定A.1.3.1菌落形态在血平板和MHC培养明上形成中等大小、无色步透明、表面光滑的曲落，由落边缘整齐。在沙门值科玛嘉培养基上形成中等大小、紫红色、表面光滑、边缘整齐的微落。A.1.3.2形态染色为革兰阴性短杆菌.A.1.3.3初步生化鉴定从分岗培养平板上挑取3个5个可疑菌落，分别借种到以下培养基：双相帙斜面（KIA）说三糖铁斜面（TSI）和动力-碇%质-尿素半固体（MlU）各一支,36C1*C培养18h-24h.观察生化反应（见表A.1）.表AT伤寒、的伤寒沙门菌初步生化鉴别表菊种KlATSIMlU创面/底层产气HJS动力WiK大肠埃为的A
6、ZA-+A-志贽曲柝ICA-+/-愕塞沙门的K/A+X-*-甲型剧饬东沙门的K/A-乙型副伤东沙门曲ICA-内取刖伤东沙门MKA-I注，A产取（优色IK不产取（红色）,，阳性,-阴性t+/-多数阳性I多效Rll性.IA.1.3.4系统生化鉴定肠杆曲科细菌各属之间，在生化方面有类似之处，抗原方面也可有交叉反应，有时可出现不典型的储株，因此，仅做般生化反应和血清学鉴定，不能做出正确的结论，应进一步做系统的生化反应鉴定，可采用商品化的系统生化鉴定板条进行鉴定,伤寒、副伤寒沙门曲的主要生化特件见表A.2.系统生化不能区分乙型与丙型副伤塞沙门菌.仍应使用传统血清分型或分子血清分型方法确认.A.1.3.5
7、质谱鉴定除生化鉴定外可疑菌落可进行防谱鉴定.质谱鉴定能好鉴定沙门菌但不能区分血清型.Im满型签定仍应使用传统血清凝集试验或分子血清分型方法确定.杨讲鉴定步骤严格按照厂家说明竹进行，表A.2伤客、副伤客沙门菌主要生化特性苗型动力85乳精发芳18I麻的硫化乳A，1.尿索甲生红Vp枸松极盐H茅酵木股M阿拉模向酸蜕检憎归城酸脱成府伤黑沙门丽-十-甲R副伤寒菌-A-乙乙期伤寝面-+殷西里剧伤塞苗-给e注：-阴性不产假:，阳性（产酸:国产酸产气：+/-多数阳性,少数阴性；-/，多侬叨性，少数A.1.3.6分子生物学柴定除生化鉴定及质谱鉴定外,可疑菌落可利用分子生物学检测进行鉴定.分子生物学检测能膨区分沙门
8、菌属、伤赛沙门苗和甲型副伤塞沙门菌.具体方法见A.I.4.A,1.3.7血清玻片版柒符合伤寒、副伤寒沙门菌生化反应或质谱、分子生物学鉴定为沙门菌的菌落,转种至首养琼脂36C1C熠百18h24h后做跛片凝集试验，弁设生理盐水对照-方法；挟取甘养琼脂培养物，先用O多价血清玻片凝集，凝柒者，再选用02、0Oq和OM因子血清凝集（伤寒和丙型副伤寒沙门曲的Vi抗原能阻码。抗原凝集,必要时制成芮恩液经100C水浴3（）mm破坏Vi抗原后.以沉淀物再进行Olm清凝集.0抗保确定后，将菌株点种于诱导琼脂或软琼脂平板上，36C士C培养8h16h后，用H因子血清凝集（见表A3.若未获得11相因子（若有,则使用对应
9、的I相透导血清因子进行软琼脂反相诱导，取琼脂边缘生长黄苔进行血清凝集试验确定II相因子。沙门菌血清破片凝集是传统血清分型方法,分子血清分型方法可作为补充,但需经过5金证评估后使用.表A.3伤塞、副怫塞沙门菌血清凝集反应湎型。抗朦H抗期.Vi相Il1伤塞沙门他d-甲冕副伤有沙门情a-乙奥副伤寒沙门演b丙型制伤寒沙门脩C注：C表示该抗唳可能缺失A.1.4分子生物学检测A.1.4,1核酸制备血液、什SS、胆汁样本地曲液1In1.禹心集曲,取赭沉淀用1001.TE悬茵后，经100C水浴IOmin后围心,取卜.湎.用做PCR反应模板可疑单菌落悬于1001.无菌纯水中，采用相同方法制备模板,也可使用商品化
10、试剂盒按厂家说明书进行核酸制备.A.1.4.2荧光PCR引物引物序列见表A.4,引物纯度立为PAGE或HP1.C级别.表A4沙门菌荧光PCR引物及反应条件A!弓序列1循环fII*I1C30st然后95t5s.tV1C25s,共40个循环tfII弓I*1C百.1rImA,1.4,3荧光PCR反应体系PCR反应体系及组成见表A.5,可使用商品化试剂盒,按操作说明书进行操作.表A.5沙门曲荧光PCR反应体系组分体积R1.,X荧光PCRffl混液I上游引物（IOgmol1.）I下游引物（IOmol1.）I探针(IOmol.1.I模板III总体枳IA.1.4.4结果判定A.1.4.4.1增菌液结果判定伤
11、塞沙门商阳性：沙门储属荧光PCR和伤塞沙门由炭光PCR同时阳性（即Clff（均W33）。甲型副伤寒沙门阳阳性：沙门赭属荧光PeR和甲型副伤东沙门赭荧光PCR同时阳性（即Ct值均这33“沙门曲阳性：仅沙门菌出荧光PCR阳性（Q伯W33）.A,1.4.4.2菌落结果判定伤寒沙门两阳性：沙门菌属荧光PCR和伤寒沙门菌英光PCR同时阳性（即。值均W30）.甲型副伤寒沙门阑阳性：沙门菌旭焚光PeR和甲型剧伤塞沙门菌优光PCR同时阳性（即C值均W30。沙门曲阳性:仅眇门箔展荧光PCR阳性（Q（fiW30）。A.1.5菌株管理建立菌株保存档案,详细记录菌株的来源、分离的时间和地点、取材患拧的基本信息及流行形式：同上步骤分装，第7管（）：只加生理盐水作空白对照.A.2.5.4加抗原将相应抗原（TO.TH.AO、AH、BO.BH.CO.CH）加入每排各稀拜度管（孔）中.每管（孔0.5m1.最终血清稀择度分别为1:40.1:80,1:160.1:320.1:640.1:1280.1J照厂案说明书进行相应抗原的稀择。A.2.5.5妍育格已加好血消稀锌液和抗原的试管（凹娘桢振播混匀后，置36VC温箱或水浴孵Ff过夜，次H观察结果，A.2.6结果观察轻轻取出试管或凹塑板，观
