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1、一、技术名称罗非鱼链球菌病防控技术二、技术概述该技术从病原-宿主-绿色渔药1三个方面进行研究,建立了罗非鱼链球菌病的高效匏方中草药免疫增强剂防控技术.在病原方面，对引起罗非鱼链球菌病暴发性疾病的病原进行了分圈鉴定，确定该菌为无乳链球菌强毒株；进而对无乳链球菌及ECP致病性、耐药性、蛋白组学、全基因组和基因分型等生物学特征进行了系统研究，建立了链球菌1.AMP快速诊断技术；对无乳链球菌强毒株培养条件进行优化；克隆了6个毒力蛋白基因并进行了原核表达；构建了PhoB基因缺失突变株和互补株并分析了突变株生物学特性，同时比较了野生株和突变株转录组和蛋白质组图谱；鉴定得到3条有效SRNA并获取所有SRNA
2、全长，构建了SRNASAR-1缺失突变株及回补株并分析突变株生物学特性，同时比较野生株和突变株蛋白质组学图谱.在宿主方面，克隆了罗非鱼9个免疫相关基因全长CDNA序列，并对其中4个基因进行了原核表达，用表达蛋白制备了SlgM多抗并对罗非鱼4个组织进行了免疫组化分析；对灭活无乳链球菌诱导前后的罗非鱼的免疫基因的组织分布差异以及在不同组织中的时间表达模式进行了分析；通过构建NCCRP-1胞外结合区域以及胞内转录活化区+信号转导区诱饵质粒，从罗非鱼肝脏和头肾CDNA文库中筛选出11个与NCCRP-1有潜在相互作用的蛋白，证实了NCCRP-1与C-typeIectinxSerotransferrin及
3、CD28与CD80/86互作关系；对CD59的补体抑制活性.对革兰氏阳性国细胞壁结合的主要组分进行了研究.对中草药当归、黄黄、板蓝根、金银花、甘草、山楂等10种常见中草药按一定比例配制成AxB、C、D和E五种不同配方见方中草药，通过测定罗非鱼增重率、肌肉成分、血清生化指标、血清免疫指标、肠道国群变化及对罗非鱼抗无乳链球菌免疫保护力，从而筛选最佳配复方中草药免疫增强剂；结果表明B配方的复方中草药为最佳免疫增强剂，添加于罗非鱼饲料进行投喂后能有效提高罗非鱼免疫指标，增加罗非鱼抗无乳链球菌免疫保护力。对筛选的B配方的复方中草药免疫增强剂按15%添加于罗非鱼饲料中采用分段法和不间断投喂法投喂罗非鱼，分
4、析测定罗非鱼培重率、肌肉成分、血清生化指标、血清免疫指标和肠道菌群的变化，发现在罗非鱼养殖中采用分段法投喂中草药免疫增强剂是一种实用的措施；将0.5%、1.0%、1.5%和2.0%含量的复方中草药免疫增强剂添加至基础料中分别投喂罗非鱼，测定罗非鱼血清中Sc)D活力、PoD活力、Pe)活力、1.ZM活性、血清抗菌活力、MDA含量、谷丙转豆酶活力、谷草转氨酶活力、甘油三酯含量、总胆固醇含量的变化.罗非鱼头肾、脾脏、肝脏、腮、胸腺中Il1和TNF-表达模式变化，罗非鱼肠道菌群结构的变化，罗非鱼肝体比变化，罗非鱼肝脏脂肪含量和肌肉脂肪含量变化，罗非鱼免疫保护力的变化和罗非鱼肝脏组织病理学变化。发现不同
5、含量的中草药免疫增强剂饲料投喂罗非鱼后均能显著提高罗非鱼免疫力、促进肠道菌群微生态平衡、降低肝脏脂肪含量和肌肉脂肪含量、保护罗非鱼肝脏和提高罗非鱼对无乳链抵抗无乳链球菌的感染效果最好，最终筛选出中草药添加剂按1.0%添加于罗非鱼饲料为最佳中草药免疫增强剂添加量.为探究本实验室研发的用于改善罗非鱼肌肉品质和增强对链球Ii病抵抗力的中草药免疫增强剂在罗非鱼养殖中使用的安全性，我们设计中草药免疫增强剂对小鼠的急性毒性、亚急性毒性和养殖罗非鱼亚急性毒性试睑，发现中草药免疫增强剂在饲料中的添加剂量在3%以下时在罗非鱼的养殖中使用是安全的，为该中草药免疫增强剂在罗非鱼养殖实践应用中提供理论依据.中草药免疫
6、增强剂的使用能有效控制罗非鱼链球菌病，从而减少化学药物的使用，降低养殖风险，提高水产品的质量，使水产品养殖和出口的规模进一步扩大，产生良好的社会效益及生态效益。三、增产增效情况2013年-2017年本课题组研制的中草药免疫增强剂在高州市石鼓镇、镇江镇等地的罗非鱼养殖厂、高州市龙湾水库和四方田水库、雷州市溪南水库等地开展罗非鱼养殖中的应用示范，5年来建设应用示范点和示范对照点各5个，示范面积累计共达到18400亩，其中应用示范面积13200亩,示范对照面积5200亩，取得经济效益总计17039.22万元.更重要的是2013年和2017年因示范区易发罗非鱼链球菌病，示范对照点的未投喂中草药免疫增强
7、剂的罗非鱼因需防控该病而使用了化学药物来调水和治病，给周边的生态环境带来了一定的隐患，而中草药免疫增强剂的使用不仅在有效控制罗非鱼链球菌病这个养殖瓶颈上发挥重要的作用，而且中草药免疫增强剂的使用能显著减少化学药物的使用，提高养殖的成活率，降低养殖风险，提高水产品的质量，使水产品养殖和出口的规模进一步扩大，具有广阔的市场前景，因此中草药免疫增强剂的推广应用将推动罗非鱼养殖业及相关产业的可持续发展，产生良好的社会效益及生态效益.四、技术要点确定了引起我国南方罗非鱼链球菌病的病原为无乳链球菌，系统阐述无乳链球菌的生物学特性和罗非鱼体液免疫与细胞免疫在链球菌感染中的作用，并结合上述研究，研制了针对罗非
8、鱼链球菌病的中草药免疫增强剂并应用示范，达到了国际领先水平，具体技术要点如下：1 .系统阐述了无乳链球菌的生物学特性和致病机制：研究了无乳链球菌致病性、耐药性、基因分型、基因组等生物学特性，并从分子生物学、蛋白质组学与转录组学多个角度研究了重要毒力因子功能，从而深入阐述无乳链球菌的致病机制.2 .系统阐明了无乳链球菌感染罗非鱼过程中的宿主免疫反应分子机理：研究了罗非鱼免疫因子在链球菌感染中的作用，并对部分因子的作用机理以及不同因子间的互作模式进行了解析，阐明了罗非鱼免疫相关分子抗病机理.3 .研制了中草药免疫增强剂用于罗非鱼链球菌病的防治：在国内首先成功研制了针对罗非鱼链球鱼病的中草药免疫增强
9、剂，采用分段投喂的方式可提升罗非鱼的免疫力、促进肠道菌群微生态平衡、降低肝脏脂肪含量和肌肉脂肪含量、保护罗非鱼肝脏和提高罗非鱼的抗病力，经济效益显著.五、推广情况2013年-2017年，本技术中的中草药免疫熠强剂在高州市石鼓镇、镇江镇等地的罗非鱼养殖厂、高州市龙湾水库和四方田水库、雷州市溪南水库等地开展罗非鱼养殖中的应用示范.5年来建设应用示范点和示范对照点各5个，示范面积累计共达到18400亩，其中应用示范面积13200亩，示范对照面积5200亩.中草药免疫增强剂在罗非鱼养殖中的应用示范结果表明，在所有应用示范点中，罗非鱼成活率均超过95%,而示范对照点罗非鱼成活率最高仅为92.08%;所有
10、应用示范点体重超过500g的鱼占比超过91.8%,而示范对照最高仅为86.27%,在2013年和2017年，应用示范区暴发了由无乳链球菌引起的链球菌病，示范对照点在使用化学药物的情况下均有超过10%的鱼死亡，而应用示范点在没有使用化学药物情况下养殖成活率却均高达95%以上，这表明中草药免疫增强剂在罗非鱼养殖的应用示范中能有效抵抗链球函病。中草药免疫增强剂在罗非鱼养殖中的应用示范期间，示范点平均每亩比对照点净熠加收入2839.87元而每亩多投入的中草药成本平均为71.88元，5年来示范点总产值为：58228.87万元，增加净收入达17039.22万元。六、适宜推广区域海南、广东和广西罗非鱼养殖区.
