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1、DNMT3B基因启动子C46359T多态性及食管癌易感性关联分析1DNMT3B基因启动广C46359T多态性及食管癌易感性关联分析DNMT3B基因启动子C46359T多态性及食管癌易感性关联分析【摘要】目的：探讨DNMT3B基因启动子C46359T单核甘酸多态性与江苏汉族人群食管癌易感性的关系。方法：提取】95例食管癌患者及189例健康体检人员外周血基因组DNA,采纳PCPPPPPP结合DNA测序技术检测DNMT3B基因启动子C46359T单核甘酸多态性。结果：正常比照DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型频率为98.9%1.R,病例组为97.9%2.1乐在比照组与病例组中均未检测
2、到DNMT3B46359CC基因型。携带DNMT3B46359CT等位基因的个体与比照组相比，其患食管癌的易感性未见明显上升(P=O.43,OP=1.96,95%C1:0.35)0.82)O对比江苏汉族人群和英国、美国白种人群，DNMT3BC46359T单核甘酸多态性频率分布有明显差异(PIt;0.01)。结论：食管癌易感性的一个独立风险因素，此位点多态性的分布在不同人种间有显著差异。【关键词】DNA甲基转移酶3B食管癌单核甘酸多态2性毕业论文肿瘤的病因学，尤其是其与某些遗传性疾患关系的探讨已表明，大多数人类恶性肿瘤是由环境因素作用于遗传物质的结果1,遗传因素越来越被认为是癌症发病风险的主要因
3、素之一2P3o尽管有些基因突变可以导致肿瘤，但是对于大多数人来说，患肿痛的风险可能来自于相对常见的低外显率的疾病相关多态性的差异3o肿瘤不仅是遗传性疾病，同时也是由基因转录缄默所引起的表观遗传性疾病。在一些人类肿病细胞中，启动子区CPG岛的重新甲基化可能是肿瘤抑制基因失活的机制4。DNA甲基化的异样是最常见的表观遗传学变更，DNA甲基化是由一组DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)家族催化的,目前在哺乳动物中确定的DNMT有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B5P70其中,DNMTl主要负责维持甲基化,而DNMT3A和DNMT3B主要负责重新甲基化6,8。DN
4、MT3B在肿瘤形成过程中起重要作用，已经发觉在肿瘤细胞中存在DMT3B的高表达5oDNMT3B基因定位于20号染色体qll.2,在距转录起始位点-149碱基对的启动子区含有CT转换多态性（C46359T）,体外试验表明，该位点的转换可以使DNMT3B启动子的活性增加30%9o3食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在发展中国家居第5位，我国的食管癌死亡率居世界首位10。早期食管癌经手术切除后5年生存率可达90%以上，而中晚期患者仅为6%15%HP12假如能够做到早期诊断或易感风险评估，则有可能降低食管癌的死亡率。本探讨选择江苏地区汉族人群，探讨DNMT3B基因C46359T位点基因多态性
5、与该地区人群食管癌遗传易感性之间的关联。论文代写1材料和方法1.l材料毕业论文病例组选自2007年2月2007年7月在江苏省肿瘤医院、南京军区南京总医院保存的食管癌病人血液样本195例，其中男153例，女42例，全部病例临床资料完整。血液标本采集前均未有抗肿瘤药物运用记录。比照组为健康人血液样本189例，其中性别、年龄等均与病例组相匹配，男135例，女54例，见表I0两组人群均系江苏地区汉族人群，个体之间均无血缘关系。1.2方法1.2.1基因组DNA抽提采集静脉全血2ml,乙二胺四乙酸二钾（DTAP（2）抗凝，常规蛋白酶（消化后苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀法提取基因组DN6,总共提取食管膈患4者、
6、健康正常人外周血DA384例,提取的DNA溶解于pH8.0T（中，4C保存。表1病例组与比照组样本间年龄和性别分布频率比较例注：括孤中为所占百分比1.2.2PCPPCP引物序列见文献13,上游55PTGCTGTGACAGGCAGAGCAGP35(nt4615146170),下游55PGGTAGCCGGGAACTCCACGGP35(nt4653046511),扩增产物380bp251反应体系含dNTPsO.InmolP-I,上下游引物各IOpmobTaqDN聚合酶1.25U,DNA1.Ol(100ng),MgC122.OnunolP-Io95C预变性5min；95C30s,69C30s,共32个
7、循环，最终72C延长IOminoPCP产物经2%琼脂糖凝胶电泳，澳化乙锭染色视察。毕业论文1.2.3限制性内切随BinI随切反应201随切反应体系含10(Buffer2.01,Bin1(Ta(aPa公司)4U,PCP产物2.01,混匀后37C水浴中酶切过夜。酶切产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。1.2.4 DN序列测定选择凝胶电泳证明为CT基因型、TT基因型各2例，由南京金思特公司经双脱氧链终止法测序。1.2.5 统计学处理采纳SPSSl3.0统计软件进行卡方检脸,计第P值、OP值和95%CI.论文代写52结果论文代写2.1一般资料的统计学检验毕业论文经双侧卡方检验，在病例与比照组中，年
8、龄在40-60岁和gt;60岁的分别为60.0%39.5%和4。2%50.3%,男、女分别为78.5%21.5%和71.4%28.6%,均无统计学差异(Pgt;0.05),见表1论文代写2.2DNMT3B启动子C46359TPCP产物分析毕业论文PCP产物为380bp的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图Io经限制性内切筋BinI酶切后，当nt46359处为T时，BinI可将PCP产物切为207bp和173bp两个片段；当nt46359处为C时，BinI不能将PCP产物切开，只有1个380bp的片段：当nt46359处为CT时，为380bp.207bp和173bp3个片段，见图2。为证明酶切结
9、果，将凝胶电泳证明为CT基因型、TT基因型各2例PCP产物送至测序公司(南京金思特公司)进行测序，其中箭头所示为DMn3B启动子C46359T多态性位点，见图3。论文代写2.3DNMT3BC46359T等位基因频率在病例组和比照组中的分布经HardyPH(inberg遗传平衡吻合度检验，病例和比照组的基因型分布符合遗传平衡定律。结果显示，正常比照中DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型频率为698.9V1.1%,T的频率为99.47%,C的频率为0.53%；病例组中11CT基因型频率为97.9%2.1%,T频率为98.97%,C的频率为1.03%,经2检验，DNMT3BC46359
10、T等位基因TT/CT基因型频率在正常人群和食管癌患者中分布差异没有显著性(P=043),比照组与病例组中均未检测到DNMT3B46359CC基因型。见表2注：括孤中为所占百分比2.4DXMT3BC46359T等位基因频率在中国汉族人和英国、美国白种人中的分布经与文献报道的DNMT3BC46359T等位基因频率分别在英国和美国白种人9,14之间比较，显示英国、美国白种人中TT.CT和CC基因型分别占23.2%45.0%31.8%和23.2%41.8%35%,而中国汉族人TT和CT基因型分别为98.9%和1.1%,中国汉族人DNMT3BC46359T等位基因频率分布与英、美两国白种人存在显著的统计
11、学差异(PltOOl),见表3。3讨论单核甘酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核甘酸的变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率大于1%,是人类可遗传变异中最常见的一种，占全部已知多态性的90%以上15。SNP与肿病等很多疾病的易感性有关16。探讨表明，位7于基因启动子区的SNP能影响基因的表达或酶的活性13PM1.DNA甲基化在胚胎发育和印迹基因的转录抑制，如X染色体的失活以及很多人类肿痛中重要基因的异样缄默中起重要作用17。DNMT3B基因启动子区T49位C46359T多态性与乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌以及急性白血病等
12、多种肿瘤易感性有关9,M,18P20这些探讨提示该位点的遗传变异可能与多种肿瘤发病风险相关,该位点可能作为评价人群肿瘤易感性的一个指标。到目前为止，C46359T是否与食管癌易感性有关尚不清晰。表3DNMT3B基因启动子区C46359T等位基因频率注：括孤中为所占百分比食管癌是我国常见的一种消化道肿瘤，因其缺乏有效的早期诊断指标，当患者出现症状时往往为中晚期，不利于治疗，且预后不良。为了给食管癌供应一个早期诊断指标，我们对DNMT3B基因启动子区上游149位C46359T多态性与食管癌的易感性进行了探讨。本探讨所得DNMT3B基因启动子区T49位点基因型分布结果符合HardyPHanberg平
13、衡定律。正常比照组中TT基因型为98.9%,CT基因型为1.l乐病例组中分别为97.舞和2.1%,两者无显著的统计学差异(P=O.43,OP=1.96,95%CI为0.3510.82)o这说明至少在我们的探讨中，DNMT3B基因启动子区上游149位C46359T多态性与食管癌易感性之间可能无显著的相关性。这有可能是由于在不同的细胞组织中DNMT3B的不同剪切8子催化活性有差异8,或者是DNMT3B活性的抑制不能使一些细胞系中高甲基化的肿痛抑制基因激活21P22,而且在不同肿瘤中,C和T所代表的风险因素也不同，如在肺癌中，DNMT3BC46359T的CT+TT基因型所患风险几乎是CC基因型的两倍
14、20；而在乳腺癌中，CT+CC基因型风险率显著高于TT基因型9,这说明在不同的肿瘤中DNMTS作用的困难性。本探讨结果还显示中国汉族人的基因型分布与英国、美国白种人有显著不同(PltiO-Ol)0有关中国人群该位点的探讨结果发觉，此CT基因型在中国汉族为2.5虹16,北方地区为5.119,正常比照组中均未检出CC基因型，这种分布的显著差异的机制还没有明确。DNMT3B多态性的生物学功能，以及其在肿瘤发生过程中的作用还有待进一步探讨。此位点与食管癌易感性的相关性还须要在其他种族中进行探讨。(参考文献】吕宝忠,赵寿元.肿招遗传学国.北京:科学出版社，1998：98.2H(B(PBP,NATHANS
15、ON(P.PowpenetrancegenesassociatedwithincreasedriskforbreastcancerJ.9(urJCancer,2000,36(10)E1193P1199.3POND(PBA.Cancergeneticsj.Nature,2001,411(6835)E336P341.4(NGC,H(PMANJG,BAYPINSB.AbirdseyeviewofglobalmethylationJ.NatGetet,2000,24(2)E101P102.5POB(PTSON(D,(YOMAPSI(,GONZAP(SP,etal.DifferentialmPNAexpressionofthehumanDNAmethyltransferase(DNMTs)1,3aand3bduringtheGOG1toSphasetransitioninnormalandtumorcellsJ.NucKicAcidsPes,2000,28(10)E2108P2113.6MIZUNOS,CHIJIHAT,O(AMUPAT,etal.(xpressionofDNAmethy1transferasesDNMT1,3A
