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1、ER应激蛋白在免疫性关节炎滑膜中的表达ER应激蛋白在免疫性关节炎滑膜中的表达#冯利杰1,4,周应2,4,余长亮3,沈玉君4,沈玉先1,4,李俊2*（1.安徽医科高校基础医学院，合肥，230032：2.安徽医科高校药学院,合肥，230032：3.安徽医科高校第一附属医院，合肥，230032；4.安徽医科高校生物药物探讨所，合肥，230032）摘要：目的视察内质网（ER）应激蛋白在免疫性关节炎滑膜组织中的表达，探讨ER应激51015在免疫性关节炎症中的作用。方法13只雌性新西兰大白兔，随机分为正常比照组和模型组。模型组兔膝关节腔内注射甲基化牛血清白蛋白（i11BSA）诱导免疫性关节炎模型，HE染色
2、视察滑膜组织病理变更；KT-PCK检测滑膜组织中ER应激蛋白BiP.CHOP的mRNA水平：免疫组化和免疫荧光双标检测BiP和CHOB在滑膜组织中的表达和细胞定位。结果模型组兔出现明显的美节炎症状，病理变更表现为滑膜组织增生，炎性细胞浸润等；巨噬细胞激活的标记性蛋白CD68及成纤维细胞的标记物a-SMA发达明显增多。在炎性增厚的滑膜，BiP.CHOP表达明显增加，免疫荧光双标结果显示BiP在a-SMA、CD68阳性细胞中均有表达，而CHOP主要在a-SMA阳性细胞表达，在CD68阳性细胞中几乎不表expressionsofBiPandCHOPweredeterminedbyRT-PCR.The
3、cellularlocalizationofBiPandCHOPinthesynoviumswasexaminedbydouble-Iabeledimmunofluorescence.ResultsAIAmodelwasestablishedsuccessfulIyand-SVAandCD68expressionremarkablyincreased.BiPwasextensivelyexpressedinbothmicrophage-andfibroblast-1ikesynoviocytesofinflammatorysynoviums.However,CHOPlocalizedmainl
4、yinfibroblast-likesynovicytes,butfewexpressedinmicrophage-1ikesynoviocytes.ConclusionERstressinducibleproteinexhibitedselect!veexpressionininflammatorysynovium,whichmaybeexplainwhyinflammatorysynoviocytesresistanttoERstressinducedapoptosis.Keywords:Rheumatoidarthritis;endoplasmicreticulumstress;unfo
5、ldedproteinresponse;BSize(bp)GGTTTGCTGTGGGGG275bpAntisenseHgtcttcagctgtcactcgSenseGGAGCTGGAAGCCTGGTATGA402bpAntisenseTCCCTGGTCGGCGCTCGT11SenseTcaccaactgggacgacat192bpAntiSenSeGCCGCCTGGTGCCCHOP-actin1.2.4免疫荧光双标记切片常规脱腊至水，微波抗原修第，用含0.5%TritonX-100,5%羊血清的PBS封闭液室温封闭30min,一抗4C野育过夜；荧光标记的二抗37C避光孵育1h；80%甘油封片。
6、85用PBS缓冲液替代一抗作阴性比照。荧光显微镜下视察，摄像。1.2.5统计学方法计量资料的数据以均数标准差（XS）表示，组间数据的显著性检验采纳单因素方差，2结果90951002.1AIA兔滑膜的病理组织学变更光学显微镜下可见正常关节滑膜衬里层由2层滑膜细胞组成，且部分不连续，滑膜衬里下层为脂肪细胞，未见炎症细胞浸润（图1A,O；而模型组滑膜衬里层明显增厚，衬里层细胞由r2层渐渐增加至1015层，有较多的乳头样突起（图1B），滑膜下层纤维组织增生，大量炎细胞浸涧，脂肪细胞消逝，新生血管明显增多，血管四周可见大量淋巴样细胞浸润（图ID）o图1兔膝关节滑膜组织HE染色Fig.1HEstainin
7、goftherabbitssynovialtissues（）正常滑膜组织：（B）炎症滑膜组织；（C）A图方框区域放大图片；（DB图方框区域放大图片。图中标尺=50m.-3-2.2AIA兔滑膜细胞的激活免疫荧光染色检测滑膜组织中巨噬细胞激活的标记性蛋白CD68及成纤维细胞的标记物-SMA的表达状况，结果发觉，正常滑膜组织中CD68和-SMA的荧光强度较弱（图2A和C）,而模型组滑膜组织中CD68和-SMA的免疫荧光强度明显增加，提示这两种蛋105白的表达量增加（图2B和D）,表明在兔AIA模型中这两类滑膜细胞均被激活。图2.IA兔滑膜细胞中-SMA和CD68的表达Fig.2Expressions
8、ofCD68and-SMinsynovialtissueofrabbits免疫荧光染色检测-SMA（A、B）和C）68（C、D）在正常（A,C）和炎症（B,D）滑膜组织中的表达。图中标尺=100m1101151202.3ER应激蛋白BiP在滑膜组织中的表达和定位BiP是内质网中主要的分子伴侣，其作用是保持底物蛋白处于易于折橙的状态，因此常作为ER应激的标记性蛋白5我们用抗BiP多克隆抗体对兔滑膜组织进行免疫荧光染色，结果发觉，正常滑膜中有少量BiP表达（图3A）,而炎性增厚的滑膜组织中BiP表达明显增多，且主要定位于胞浆（图3B）；RT-PCR结果也同样显示，模型组滑膜组织中BiP的mRN水平
9、明显高于正常比照组（图3C和D）,提示炎症能诱导BiP的表达上调。为了鉴定滑膜组织中表达BiP的细胞类型，我们将BiP分别和CD68、-SMA进行免疫荧光双标，结果发觉BiP在-SMA.CD68阳性细胞中均有表达（图4）。提示炎症能诱导滑膜组织中F1.S和巨噬细胞样滑膜细胞（macrophage-1ikesynoviocytes,M1.S）发生ER应激。-4-125130135图3.BiP在兔滑膜组织中的表达Fig.3ExpressionofBiPinrabbitsynovialtissues（八）BiP在正常滑膜组织中的表达；（B）BiP在炎症滑膜组织中的表达：图中标尺=50m：（C）RT-
10、PCR检测正常和炎症滑膜组织中BiP的mRNA水平：（D）对C图的半定量分析，与正常滑膜组织相比，*P0.Olo图4.滑膜组织中表达BiP的细胞类型Fig.4ThecellularlocalizationofBiPinsynovialtissuesfromIrabbits（Al-A3）免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中a-SM和BiP的表达：a-SM（红），BiP（绿），3是l,A2合并后的图片：（BIf3）免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中CD68和BiP的表达，CD68（红），BiP（绿），B3是Bl,B2合并后的图片。图中标尺=50mo2.4ER应激蛋白CHOP在滑膜组织中的表达和定位核转录因子
11、CHOP是C/EBP家族成员，正常状况下低表达或不表达，ER应激能诱导其表达上调，也常被作为ER应激的标记性蛋白6.免疫荧光染色结果发觉，与正常滑膜相比，-5-炎性增厚的滑膜组织中CHOP表达增加（图5B）；RT-PCR结果显示，模型组滑膜组织中CHOP的mRNA水平较正常比照组略有增加（图5C和D）。提示关节炎症能诱导CHOP表达上调。同样，为了鉴定滑膜组织中表达CHOR的细胞类型，我们将145CHOP分别和-SMA.140150CD68进行免疫荧光双标，结果发觉CHOP只在-SMA阳性细胞中表达，而在CD68阳性细胞中不表达（图6）o提示CHOP可能在炎症诱导的F1.SER应激中起重要作用
12、，而不参加M1.S的功能调整。图5.CHOP在兔滑膜组织中的表达Fig.5ExpressionofCHOPinrabbitsynovialtissues（八）CHOP在正常滑膜组织中的表达；（B）CHoP在炎症滑膜组织中的表达；图中标尺=50m；（C）RT-PCR检测正常和炎症滑膜组织中CHOP的mRNA水平；（D）对C图的定量分析，与正常滑膜组织相比，*P0.05。图6.滑膜组织中表达CHOP的细胞类型Fig.6ThecellularlocalizationofCHOPinsynovialtissuesfromAIArabbits（Al-A3）免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中a-SM和CHOP
13、的表达：a-SMA（红）,CHOP（绿），3是Al,A2合并后的图片；（BI-B3）免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中CD68和CHOP的表达，CD68（红），CHOP（绿），B3是Bl,B2合并后的图片。图中标尺=50Hio-6-3结论155越来越多的证据表明ER应激以及UPR通路的功能失调与很多炎症免疫性疾病的发生发展有着亲密的联系。大量体外试验证明干扰ER平衡和线粒体代谢的病理因素都可以导致UPR和炎症反应。而延长的1.PR和炎症反应可能相互作用，共同构成一些免疫性疾病，如代谢性疾病，神经退行性疾病，自身免疫性疾病以及感染性疾病的病理基础7。在R的发生发展过程中，增殖浸润的滑膜细胞和其他炎性
14、细胞均可分泌大量的炎性细160165170胞因子，后者乂可诱导滑膜细胞合成各种蛋白，包括细胞因子和蛋白梅，以加重组织的破坏。这种炎症性的环境不行避开的影响局部细胞ER内的蛋白折叠，并引起错误折叠的蛋白聚集。另外，RA炎症关节内的长期缺氧也可能诱导ER应激。已有探讨发觉RA滑膜细胞核内有ER定位的转录因子TF6的激活8。因此，我们推想ER应激和UPR信号通路在R的病理机制中起着重要的作用。BiP是一类分子伴侣，属于热休克蛋白70(Heatshockprotein70,Hsp70)家族，在非应激状态下，BiP与PERK、IREl和TF6结合，封闭了它们的信号传导通路。当非折叠蛋白在ER内聚集时，B
15、iP被释放出来，并与非折叠蛋白结合，以便阻挡非折叠蛋白输出ER5o因此，BiP常被作为ER应激的标记性蛋白。最近的探讨发觉BiP在RA滑膜组织中高表达，并选择性刺激滑膜T细胞增殖，80%RA患者血清中存在抗BiP抗体9。在胶原诱导的大鼠关节炎(collagen-inducedarthritis,CTA)模型和进展期骨关节炎病人中也存在类似的结果10,11O此外，外源性的重组人BiP能促进外周血单核细胞中抗炎因子I1.TO的表达，抑制TNF-的表达，从而起到抑制炎症的作用12o在本探讨中我们发觉BiP在炎症滑膜组织中表达上调，且在F1.S和M1.S中均有表达。提示免疫性关节炎症能诱导ER应激。依据以往文献报道，我们推断BiP可能具有抑制炎症的作用，那么如何说明在BiP表达175180185190195上调以及ER应激激活的状况下，炎性滑膜细胞仍旧处于高度增殖的状态？我们推想，RA中是否还存在其他调控细胞增殖与凋亡平衡的因素存在，从而影响滑膜细胞的功能。因此我们检测了CHOP的表达状况。CHOP属于C/EBP转录因子家族的凋亡前因子，也是公认的ER应激的标记蛋白。在生理状况下CHOP不表达或低水平表达，ER应激能诱导其表达上调。CHOP是ER应激与细胞凋亡的重要中间信号分子，CHOP/细胞对ER应激诱导凋亡的敏感性下降13。探讨发觉CIA鼠F1.S中CHOPmRN和蛋白
