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1、G-CSF动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病的影响G-CSE动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病的影响作者：刘庆国，杨栋林，黄勇，姜尔烈，周世勇，何依，王志东,王玫【摘要】为了探讨粒细胞集落刺激因子(G-CsF)动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响，对20例供者G-CSF动员前后的外周血样品，加入佛波醇防、伊能源素、莫能寄素体外刺激培育4小时，以3色荧光标记法流式细胞术检测T细胞亚群I(分泌INF-、INF-)、II型(分泌I1.-4、11.-5和11.-10)细胞比例。结果表明：G-CSF动员前外周血CD3+IFN-+、CD4+IFN
2、-+和CD8+IFN-+T细胞的比例分别为3.2%(0%-45.9%)、1.3%(0%-23.8%)和1.5%(0%-22.2%),G-CSI-动员后前述细胞比例显著上升，分别为19.2%(0%-53.9%)、9.5%(0%-49.5%)和7.5%(0%-38.1%).动员前CD3+I1.-2+、CD4+I1.-2+、CD8+I1.-2+T细胞比例分别为1.5%(0%-31%)、O.8%(0%-30.0%)和0%(0%-5.3%),动员后比例亦明显上升，分别为25.7%(0%-51%).19.8%(0%-39.7%)、4.6%(0%-20.9%)。T细胞各亚群的I1.-4阳性细胞比例在动员后上
3、升不明显。移植早期aGVHD发生组供者的Tcl细胞比例显著高于无aGVHD组。动员后高Tc2比例组，其受者中、重度aGVHD的发生率明显低于低Tc2比例组（分别为20.0%和77.8%）o结论：G-CSF动员使供者外周血的I型T细胞比例增加，动员后高Tcl细胞比例与移植早期aGVHD发生相关，Tc2比例与中重度aGVHD发生率负相关。【关键词】G-CSF动员：T淋巴细胞亚群；移植物抗宿主病InfluenceofG-CSFMobilizationonFunctionsofDonorT1.ymphocyteSubpopulationandAcuteGraft-versus-HostDiseaseA
4、bstractToinvestigatetheinfluenceofG-CSFmobilizationonfunctionsofdonorTlymphocytesubpopulationandacutegraft-versus-hostdisease,peripheralbloodsamplesof20healthydonorswerecollectedbeforeandafterG-CSFmobilization.Thewholeb1oodwasdilutedwithIMDMinrat100f1:1andthenincubatedwithPM+ionomycinmonensinat37,5%
5、C02for4hours.Afterbeingmoblizedandstained,theI1.-4,IFN-andI1.-2positivecellswerecountedwiththree-colorflowcytometry.TheresultsshowedthatbeforeG-CSFmobiIizationthepercentagesofdonorSCD3+IFN-+,CD4+IFN-+,CD8+IFN+Tcellswere3.2%(0%-45.9%),1.3%(0%-23.8%)and1.5%(O%-22.2%)respectively.Thepercentageofaboveme
6、ntionedcellsindonorincreasedto19.2%(0%-53.9%),9.5%(0%-49.5%),7.5%(0%-38.1%)respectivelyafterG-CSFmobiIization.TheI1.-2positiveCD3+CD4+andCD8+Tcel1percentageinPre-G-CSFmobilizeddonorswas1.5%(0%-31%)，O.8%(0%30.0%)and0%(0%-5.3%)respectivelyandsubsequentlyincreasedto25.7%(0%-51%),19.8%(0%-39.7%),4.6%(0%
7、20.9%)respectivelyafterG-CSFmobilization.TheI1.4positiveTsubpopulationdidnotincreasedsignificantlyafterG-CSFmobi1ization.Intheearlystageafterperipheralbloodstemcelltransplantation,donorSTclpercentageinaGVH)groupwassignificantlyhigherthanthatinnon-aGVHDgroup.ThemorbidityofsevereaGVHDinhighTc2percenta
8、gegroupwassignificantlylowerthanthatinlowTc2percentagegroup.ItisconcludedthatthedonorstypeITcellsincreaseafterG-CSFmobi1izationIhcTclpercentageofG-CSFmobilizeddonoriscorrelatedwiththeoccurrenceofaGVHDintheearlystageafterHSCT,thepercentageofTc2indonorisnegativelycorrelatedwithaGVHDmorbidityinrecipien
9、ts.KeywordsG-CSFacutemobilization：Tlymphocytesubpopulation：graft-versus-host-disease急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植（alIo-HSCT）的常见并发症,aGVHf）的发生率高达30%-80%,发生aGVHD者因干脆和间接缘由而死亡的发生率可达50%loaGVH）主要由T细胞介导，这个病理过程起始于移植物中供者T细胞与受者抗原相遇，随后供者T细胞识别受者抗原发生克隆性扩增，其不仅干脆通过细胞毒作用对组织细胞进行攻击，并通过分泌细胞因子间接造成组织损伤。依据细胞因子的产生，T淋巴细胞被分类为1
10、型和H型T细胞。分泌IFN-、TNF-的CD4+T细胞（Thl）和CD8T细胞（TCl）被认为是I型T细胞，其在免疫应答过程中诱导细胞介导的免疫和迟发型免疫反应，在抗病毒和清除细胞内抗原方面发挥作用。分泌I1.-4U1.-5和I1.-IO的CD4+T细胞（Th2）和CD8+T细胞（Tc2）被认为是H型T细胞，其主要通过促使B淋巴细胞产生IgE和募集嗜酸、嗜碱粒细胞诱导过敏反应，在清除细胞外抗原方面发挥作用2,T细胞群的细胞因子谱可因刺激和所处微环境不同而转换为I型或11型免疫应答。在人类和小鼠的免疫系统中，H型细胞因子能抑制T细胞增殖和Thl细胞因子的产生。由Th2分泌的I1.T具有抑制Tcl
11、合成I1.-2的作用,并能下调I型细胞的因子合成、细胞增殖和长期细胞毒性。虽然Tcl和Tc2细胞都具有细胞毒作用，但Tc2的细胞毒作用相对较弱。与Tcl分泌高水平IFN-并促进Thl细胞发育相反，Tc2分泌11,-4不仅对Th2细胞起促进作用并能抑制Thl细胞发育。因此，I型和H型T细胞相互调整，两者之间的平衡确定着细胞免疫和炎症反应的特征。在造血干细胞移植中，绝大多数受者的aGVHD发生于T细胞免疫重建后，而由于放、化疗预处理及皮质激素应用导致了胸腺功能异样3,T细胞免疫重建有赖于移植物中成熟T细胞扩增4o因此，供者T细胞的免疫功能特征影响着受者移植后免疫。异基因外周血干细胞移植(alIo-
12、PBSCT)的移植物中含有比骨髓移植物高10-20倍的T细胞，但aGVHD的发生率和严峻度并无明显增加，而慢性移植物抗宿主病(CGVHD)的发生率显著增高，提示供者T细胞功能在G-CSF动员后具有独特的特征。在本探讨中，我们应用佛波醉酯(PMA)+伊能霉素(ionomycin)和莫能霉素(Oionensin)刺激培育G-CSF动员前、后供者外周血标本，用流式细胞术检测T细胞亚群的1、Il型细胞比例的改变,探讨供者T细胞亚群I、II型细胞的比例与aGVHD的相关性，以期有助于了解aGVHD的发朝气制。材料和方法病例标本取自2002年11月至2003年7月间在我院进行aIo-PBSCT的20例患者
13、。供者中位年龄46岁（21-63岁），其中女13例，男7例：受者中位年龄31岁（14-46岁），其中女4例，男16例。患者疾病类型包括急性淋巴细胞白血病5例（第1次完全缓解期2例，第2次完全缓解期2例，部分缓解1例），急性粒细胞白血病第1次完全缓解期4例，慢性粒细胞白血病10例（慢性期7例，加速期2例，急性变1例），重型再生障碍性贫血1例。供者外周血干细胞动员采纳惠尔血（日本麒麟公司）5g/kg皮下注射，1口2次，于第5和第6天采集干细胞。患者预处理采纳单次全身照耀（TBl）7Gy+环磷酰胺（CY）60mgkg2天+阿糖胞昔lgm2,12小时1次2天方案，或者马利兰（BU）4mg（kgd）4天
14、+CY60mg/kg2天方案。aGVHD预防采纳FK5060.03mg/kg,或者FK506+抗CD25单克隆抗体+MTX联用。aGVHD的诊断标准依据文献K5o主要试剂CD8-PerCP（SK2克隆八PerCP-isotype（X40克隆）、I1.-2PE（5344.Ill克隆）购自BectonDickinson公司，I1.-4-PE（4S.B3克隆）、IFN-PE（4S.B3克隆）、PE-isotype（MouseIgGl）以及CD3-FITC（SK7克隆）购自BectonDiCkinSOn-法默金公司。溶血素（BDICS1.ysingSolution）、破膜剂（BDFACSPermcab
15、iIizingSolution2）均购自BcctonDickinson公司。PMA、伊能霉素（ionomycin）、莫能霉素（monensin）购FlSigma公司。IMDM培育基、胎牛血清等购HGibcoBR1.公司。标本实行用肝素抗凝管分别在供者外周血干细胞动员前、动员后收集外周血1mlo细胞培育肝素抗凝全血1ml与IMDM1：1在培育皿中混匀，并加入佛波醇酯（10ngml）和伊能霉素（500ngml）.莫能霉素（1.7gml）,37C、5%C02孵箱中孵育4小时。细胞表面染色及胞内染色将201CD3-FITC和CDS-PerCP分别加入Falcon管中。将培育4小时后的稀释全血2001分
16、别加入上述各Falcon管，涡旋混匀，室温避光孵育15分钟。15分钟后，各管中加入2-3mlIFACS溶血素混匀，室温避光孵育10分钟后500g离心5分钟，弃上清。分别加入】破膜剂（BDPermCrCia2）5001涡旋混匀，室温避光孵育10分钟。完毕后加入2-3ml洗液（含2%热灭活胎牛血清和0.1%氮钠的PBS）,离心500g5分钟后弃上清。在比照管中加入PETsolypc,检测管中分别加入I1.-4-PE、IFN-PE,室温避光孵育30分钟。用洗液洗1遍，弃上清，以1%多聚甲醛悬浮细胞至5001待测。流式细胞术检测分析样本在FACSCaIibUr流式细胞仪上进行检测，应用CelIQUeSt软件进行测定和分析。首先在前向散射光（FS
