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1、GFP基因裸鼠脾sfi微擘察GFP转基因裸鼠脾脏组织学视察方天，尤金炜，张立波，田小芸，刘彪，吴正林，许龙祥，周森妹，赵志刚，悻时锋*（南京军区南京总医院比较医学科，全军试验动物科普与伦理教化基地，全国科普教化基地，江苏南京，210002；）摘要：目的探讨GFP基因导入对BAI.Bc荧光裸鼠脾脏组织学及免疫功能的影响。方法取不同日龄（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）BA1.Bc荧光裸鼠及BA1.B/c一般裸就各32只，雌雄各半，处死取脾脏，对脾脏的肯定重量、脾脏指数进行测量分析，对脾脏的组织学变更进行视察，并对脾脏淋巴细胞数进行统计分析，结果与14日龄荧光裸鼠相比，28日龄荧光裸鼠脾脏
2、指数明显较高（P0.05）。与14日龄荧光裸鼠相比，49日龄、70日龄荧光裸鼠淋巴细胞数明显变少（p0.05）。与一般裸鼠（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）相比较，相同日龄荧光裸鼠（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）淋巴细胞数明显削减（p0.05）.结论GFP基因对不同日龄荧光裸鼠的脾脏发育及其功能有肯定影响。关键词：GFP基因；荧光裸鼠；脾脏：免疫功能引言BA1.B/c裸小鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠，目前已成为医学生物学探讨领域中不行缺少的试验动物模型。特殊是在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的平安性评价及有效药品的筛选等试验方面，它有着特殊的价值1。目前已将HU基因导入不同近
3、交系动物，成为系列动物模型，我国所应用的Fl发性免疫缺陷小鼠，主要应用的是BA1.B/c遗传背景的裸鼠。B1.Bc荧光裸鼠是将GFP基因导入B1.Bc-nunu小鼠而得。来源于水母(AequoreaVictoria)的绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP),现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。荧光成像具有箍洁操作、所得结果直观、灵敏度高等特点，在活体动物体内成像中可得到广泛应用2-5。GFP转基因裸鼠因自身含有标记蛋白与一般裸鼠相比而具有明显的优势，但在饲养以及繁殖过程中发觉，荧光裸鼠繁殖率低、存活率、免疫力低下，更难获得相宜于试验的荧光裸
4、鼠。这一现象与外源GFP基因对小鼠发作者简介方天(1984-),女,硕士，南京军区南京总医院比较医学科技师。通讯作者悻时锋(1965-),男，主任技师，教授，博士，探讨生导师，从事医学试验动物学工作。育存在肯定毒性的报道不约而同6。本试验所选用的荧光裸鼠均为本科室工作人员通过多年杂交选育工作取得，选育方法：选择自带GFP转基因的C57Bl6小鼠与B1.Bc裸鼠杂交，并与B1.Bc裸鼠回交并经逐代选育，选育至第六代，产生了GFP基因表达较为稳定的BA1.B/c绿色荧光裸鼠。C57B1./6中插入的GFP绿色荧光蛋白基因序列号为：GenBank1.29345.1,同时转入鸡-actin启动子序列；
5、原始导入的外源基因：包括GFP基因，和限制其表达的PromOter（C的Ckenbeta-actinpromoter）,同时转入巨细胞病毒的增加子，增加GFP基因表达。本试验应用这两种动物模型，视察荧光裸鼠随日龄增长脾脏组织学变更与否，并探讨GFP基因的导入对裸鼠的脾脏发育、组织学形态以及功能是否有影响。1材料和方法1.1试验动物分组与饲养试验动物采纳SPF级不同日龄（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄）BAUVc荧光裸鼠32只，每个特定口龄阶段取8只，雌雄各半：以及不同口龄（14日龄、28日龄、49日龄、70日龄BA1.Bc一般裸鼠32只，每个龄阶段取8只，雌雄各半。BAuVC荧光裸鼠和
6、BA1.B/c一般裸鼠均由本科室工作人员选育，本科室试验动物运用许可证编号：SYXK（军）2007-029;试验动物生产许可证编号：SCXK（军）2007-012。1.2 试验方法与探讨指标1.2.1脾脏肯定重量和脾脏指数的测定每组动物按在试验设计中的口龄处死，称重，无菌条件下取出脾脏称重。用小鼠脾脏的重量除以各自体重，求相对湿重即为脾脏指数，以mg/g表示。1.2.2 光镜视察脾脏组织常常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色。光镜下视察脾脏组织形态差异。计算并比较各组切片淋巴细胞数：用目镜测微尺为标线，以脾中心小动脉为中点，分别计算压在标线上两边的淋巴细胞数，求均数为一个中心小动脉四周
7、淋巴鞘的淋巴细胞数，按同样方法计算3个脾中心小动脉四周淋巴鞘的淋巴细胞数，取均数即为脾中心小动脉四周淋巴鞘的淋巴细胞数11。1.2.3 荧光显微镜下视察28口龄荧光裸鼠的脾脏取出后制作成冰冻切片用荧光显微镜在48Onm激发光下进行视察；M日龄、28口龄、49口龄、70口龄荧光裸鼠无菌条件下取出脾脏后马上用荧光显微镜在480nm激发光下进行视察。1.3 统计学处理数据以均数标准差表示，采纳SPSSl1.5统计学软件包分析。P0.05表示差异显著。2结果荧光裸鼠与一般裸鼠体束、脾脏肯定重量和脾脏指数经方差分析发觉，同一口龄荧光裸鼠与裸鼠之间体重、脾脏肯定重量和脾脏指数差异无统计学意义。荧光裸鼠组各
8、口龄阶段比较结果如下：与14日龄组荧光裸鼠比较，28日龄组体重、脾脏肯定重量和脾脏指数明显增大（P0.05）：49口龄组体重、脾脏肯定重量明显增大（P0.05）,但脾脏指数差异不显著；70日龄组体重、脾脏肯定重量明显增大（P0.05）,脾脏指数差异也不显著（表1）。各日龄阶段脾脏切片HE染色结果：在光学显微镜下视察一般裸鼠脾脏结构清楚明显，白髓与红粉界限较明显，脾小结、中心动脉和动脉四周淋巴鞘清楚可见，淋巴细胞密集。同一日龄阶段的荧光裸鼠与一般裸鼠相比，M日龄、28日龄、49口龄、70口龄荧光裸鼠脾脏淋巴细胞数较少，淋巴细胞密度稀疏:并含有更多脾小动脉（图1）。荧光裸鼠各组别间进行比较结果是：
9、与14日龄荧光裸鼠相比，49日龄、70日龄荧光裸鼠淋巴细胞数较少、淋巴细胞密度较低（图1、图2、表2）。28日龄荧光裸鼠脾脏冷冻切片视察结果：被膜厚，绿色荧光蛋白表达明显，荧光光线亮、荧光强度强，白髓结构多而典型且荧光亮度更亮，红髓结构荧光强度稀疏，移行区明显（图3）。14日龄、28日龄、49日龄、70日龄荧光裸鼠脾脏实体视察结果:脾脏内绿色荧光蛋白(GFP)表达持续稳定，且表达量较多；其中心荧光强度最大，并呈散射状向四周扩散(图4)o表1荧光裸鼠脾脏肯定重量和脾脏指数Tab.lTheweightofspleenandthespleenindexinnudemicewithGFP组别Group
10、体重(g)ThebodyWeight(g)脾脏肯定重量(mg)Theweightofspleen脾脏指数(mgg)Thespleenindex14口龄14days7.300.1948.478.826.631.5728日龄28days13.962.16*140.0412.33*10.171.38*49日龄49days20.411.72*138.0213.84*6.762.0470日龄70days22.080.93*135.3312.50*6.131.05注：与14日龄组比较，*PO.05oNote:Comparedwith14days,*PO.05.表2荧光裸鼠、一般裸鼠脾脏淋巴细胞数Tab.2
11、ThesumoflymphocytecellsinnudemicewithGFPandnudemice组别Group荧光裸鼠ThenudemicewithGFP一般裸鼠ThCnudemice14日龄14days576.297412.5028口龄28days545.58682.6549口龄49days431.53,*656.6770日龄70days355.50,*699.93注：与一般裸鼠比较aPO.05：与14日龄组比较*P0.05,Note:Comparedwiththenudemice,p.05;Comparedwith14days,*p.05.图1脾脏切片(HE)A.14日龄荧光裸鼠；B
12、.14口龄荧光裸鼠；C.28口龄荧光裸鼠:D.28口龄荧光裸鼠：WP:白瞳RP:红髓:SN：脾小结；P1.S:动脉四周淋巴鞘:CA:中心动脉；Bar=100UmFig.1Thespleen(a、BThenudemicewithGFPat14daysc、dThenudemicewithGFPat28days)图2脾脏切片(HE)E.49口龄荧光裸鼠；F.49日龄荧光裸鼠；G.70日龄荧光裸鼠；H.70日龄荧光裸鼠；WP:白髓：RP:红髓；C:被膜：P1.S:P1.S:动脉四周淋巴鞘：Bar=100umFig.2Thespleen(E、FThenudemicewithGFPat49daysG、HT
13、henudemicewithGFPat70day)图3荧光显微镜下28日龄荧光裸鼠的脾脏冷冻切片C:被膜；WP:白髓；Bar=100umFig.3ThespleenofthenudemicewithGFPat28daysunderfluorescencemicroscope图4荧光显微镜下荧光裸鼠的脾脏a.14口龄荧光裸鼠，明场；b.14口龄荧光裸鼠，暗场；c.49日龄荧光裸鼠，明场;d.49日龄荧光裸鼠，暗场：WP:白髓；CA:中心动脉；Bar=100UmFig.4ThespleenofthenudemicewithGFPunderfluorescencemicroscope3探讨脾脏由白髓
14、、边缘区和红船组成，在机体的免疫应答过程中起到了重要作用。白髓是淋巴细胞密集的区域，由脾小体和动脉周鞘组成，其中脾小体是B淋巴细胞密集的区域，机体免疫功能活跃时，脾小体中可出现生发中心，动脉周鞘是T淋巴细胞密集的区域。边缘区是白髓向红髓移行的区域，含有大量的巨噬细胞和一些T、B细胞，以B细胞较多。边缘区最先接受抗原刺激并发生免疫应答的场所7-9。当机体受到抗原刺激时，抗原经巨噬细胞加工处理后，在T细胞的协同作用下，脾小体的B淋巴细胞增殖产生大量的效应B细胞，B细胞可分化为浆细胞分泌抗体，参加体液免疫1071O木试验中，28口龄荧光裸鼠脾脏指数明显高于14口龄荧光裸鼠、49日龄荧光裸鼠和70日龄
15、荧光裸鼠（p0.05,表1）,这表明脾脏在14口龄到28口龄之间生长发育速度快，而28口龄后则基本停止脾脏个体发育；反映脾脏生长发育的变更趋势。14口龄荧光裸鼠脾脏白筋较少，其淋巴细胞密度不高，并且移行区不明显（图Ia）：28日龄荧光裸鼠的白髓结构多而典型，淋巴细胞密度较大，移行区明显（图3）；49口龄和70口龄荧光裸鼠的白髓结构有的不规则，有的较松散或仅有少量淋巴细胞组成，移行区不明显，红粉区淋巴细胞索结构突出（图2e;图2g）脾脏作为机体接受抗原刺激后产生免疫反应的场所，其组织学变更反映了机体免疫功能的变更。臼髓结构典型与否和机体受到的抗原刺激有关，随增龄，机体受到的抗原刺激增多，免疫应答实力增加，脾小结内含分化活跃的B细胞，移行区作为脾脏-血液淋巴细胞再循环的通道，可刚好动员有免疫活性的淋巴细胞发挥作用12o脾脏是机体内最大的外周免疫器官13,脾脏淋巴细胞数量多少可在肯定程度上反映机体免疫功能的凹凸14T5。与一般裸鼠相比，同一日龄荧光裸鼠脾脏淋巴细胞数较少、淋巴细胞密度稀疏（P0.05）；荧光裸鼠不同口龄组之间比较结果，28口龄之后，随日龄增长，淋巴细胞数呈减小趋势（PO.05）（表2）。这从肯定程度上说明：荧光裸鼠与同一日龄的一般裸鼠相比较，免疫功能更为低下；并且荧光裸鼠随口龄增长，免疫功能有下降趋势。荧光裸鼠持续高表达绿色荧光蛋白（GFP,
