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1、中药防治鸡汞中毒机理探讨中药防治鸡汞中毒机理探讨（技术路途）1材料1材料1.1.试验动物及样品1.1.1汞矿四周采集的样品分别在汞矿区旁边杨家湾，张家坪等村庄采集土壤、水；萝卜、玉米、大米和白菜等蔬菜各500g；当地农户笼养的鸡、鸭各3只，猪、牛、羊分别取一头，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉各500g01. 1.2试验性汞中毒动物试验动物为200只脱温鸡苗，购于贵阳市花溪区三桥某禽苗批发公司。检疫并视察一周后投入试验。1.2主要药物与试剂中药：黄芭、甘草、快苓、白茅根、白术、山药、蒲公英等购自贵州省贵阳市花溪区中医院汞标准储备液（100gm1.,国家标准物质中心）硝酸（优级纯，含量65
2、.0-68.0%,国药集团化学试剂有限公司）30%过氧化氢（优级纯，天津市东方化工厂）锐气（青岛合利气体有限公司）二甲紫（重庆川东化工（集团）有限公司）无水乙静（重庆川东化工（集团）有限公司）苏木素（武汉博士德生物工程公司）多聚甲醛（天津市同鑫化工厂）中性树胶（中杉金桥生物公司）石蜡（熔点：57-61,上海标本模型厂）SOD超氧化物歧化诲（鼎国生物技术有限责任公司）GS1.1.-PX谷胱甘肽过氧化物酶（鼎国生物技术有限责任公司）MDA丙二醛（鼎国生物技术有限责任公司）AST谷草转氨W（鼎国生物技术有限责任公司）1.3主要试验器材SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）PE-
3、6800VET全自动血细胞分析仪（深圳市普康电子有限公司）TG1.-20M台式冷冻离心机（长沙湘仪贝克仪器仪表有限公司）SCanSPCCd微型台式离心机（丹麦1.abogene公司）BS1.1.OS电子天平（德国SARTORIUS）1.eicaRM2125切片机（德国保卡公司）VDF-382E-80C低温冰箱（SANYO公司）BCD-215KCF海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）O1.YMPUSCH20BIMF200显微镜（日本O1.YVPUS光学有限公司）PHS-3S酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）微波消解萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）ECH-I型电子控温加热板（上海新仪微波化学科技
4、有限公司）1.D4-2离心机（北京医用离心机厂）AFS-9130双道原子荧光光度冲（北京吉天仪器有限公司）Sartorius电子天平（德国赛多利斯公司）ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪（Inductive1.ycoup1.edp1.asmamassspectrometry）（北京吉天）2方法2.1汞矿四周环境及畜禽体内汞含量调查2.1.1样品采集与处理2.1.1.1土壤采集与处理采集：土壤采纳4分法则采集，每个样品从5mX5m的正方形4个顶点和中心点共5处各采集Ikg的表层土壤（0-20Cn1）,匀称混合后用4分法从中选取Ikg壤，代表该点的混合样品。样品用聚乙烯加料袋编号封装保存，防止交叉
5、污染。处理：样品带回试验室后，除去所采样品中石子，植物及其它杂质，充分风干后取部分样品，研钵捣碎研磨，过100目尼龙筛，在40C烘箱中干燥24h后干燥器皿中保存备用；将土壤样品1.Og置于250m1.锥形瓶中，用少量热蚀水润湿，加入硫酸-硝酸混合液10.0m1.,待猛烈反应停止后，加入去离子水15m1.,在瓶口插一玻璃漏斗，置于水浴锅中加热至80C,保持60nin,同时做空白比照。待加热完成后，降至室温，将试液（含残渣）全部移入100m1.容量瓶中，用去离子水洗涤锥形瓶3-5次，洗涤液并入容量瓶，加去离子水至标线，摇匀，待测。2. 1.1.2水体采集与处理采集：采纳孔径为0.04um醋酸纤微滤
6、膜现场对水样进行过滤，过滤水样装入500m1.经预先处理的超净聚乙烯瓶保存。在采集样品之前所运用的全部器皿必需先用样品水洗涤，润洗，至少3次后再将样品水装入瓶中。采样操作过程中均运用一次性聚乙烯手套，尽可能削减操作过程中带入的人为汞污染。处理：带回试验室后加5.0m1.12mo1.1.HCb置于0-4C保存,待测。2.1.1.3动物样品及农作物的采集与处理采集：选择矿区旁边农田中水稻（去壳，取其中大米）、玉米（去外包叶和玉米棒，取其中玉米粒）和蔬菜（带回试验室后先用高纯水冲洗表面，在100级干净工作台里室温下进行干燥），然后密封于3层聚乙烯样品袋中，编号，冷冻保存直到分析：鸡、鸭、猪、牛、羊分
7、别采集肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉等分装入预先处理的聚乙烯袋中，分别标记，-20C保存。处理：将已标记的动物样品及农作物分别磨碎，称取约0.2g（精确至0.0001g）经磨碎的样品，置于耐高温压力消解罐底部，加入5m1.浓硝酸（分析纯），3m1.过氧化氢（分析纯），摇匀，将消解罐密封后置于高温高压微波消解仪中消解。消解结束后，移出消解仪，待消解罐完全冷却后再开启。将消解罐中的消解液全部移至50m1.的容量瓶中，用蒸储水细致冲洗罐盖及罐壁，将洗液混入容量瓶里的消解液中，最终用蒸饰水定容至刻度，混匀，待测。试验中全部玻璃器皿均以20%硝酸溶液浸泡24h,用纯水反复冲洗，最终用超纯水冲洗晾干后
8、，方可运用。2.1.2汞含量测定方法全部样本中汞（Hg）的检测均参照GB/T5009.17-2003原子荧光光谱法计进行测定。空白比照除不加入待测试样外，其他均按上述步骤操作。2.1.2.1原子荧光光度法测定原理和步骤测定原理：原子荧光是原子蒸汽受到具有特征波长光源照耀后，其中一些F1.由原子被激发跃迁到较高能态，然后跃迁回到某一较低能态（常是基态）而放射出特征光谱的物理现象。当激发辐射的波长与产生荧光的波长相同时，称为共振荧光，它是原子荧光分析中最主要的分析线。另外还有直医线荧光、阶跃线荧光、敏化荧光、阶跃激发荧光等。各种元素都有其特定的原子荧光光谱，依据原子荧光强度的凹凸可测定试样中待测元
9、素的含量。测定步骤：(1)开机打算试验室应保持在温度15C30C,海度45%7O%之间:开启排风机，使室内保持通风状态。打开原子化器室前门，检查气液分别器中水封，须要刚好加水；检杳端动泵及压块，确保各泵管无泄漏，泵管与压块间足够润滑,否则滴加适量润滑油。检察元素灯，确定为待测元素灯，否则更换。更换元素灯时，肯定要在主机电源关闭的状况下进行，不得带电拔插。开启载气钢瓶减压阀，使次级阀压力小于03MPa,限制在0.25MPa-0.28MPa范围内。(2)操作运行接通电源，依次开启电脑、原子荧光光度计主机电源。检察元素灯光斑是否聚焦于中心位置，否则将调光器放在石英原子化炉上，依据正确方法调整元素灯至
10、聚焦。点击电脑桌面上的AFS-9130原子荧光光度计图标，运行操作软件，仪器自检。在元素表菜单进行元素灯的识别与选择后，单击确定退出对话框。点击点火点燃原子化炉，预热30min0将载流、标准空白、标准样品系列、样品空白、管理样品、未知样品溶液等配置完毕后，依据肯定依次放置在F1.动进样器的样品盘内。依据分析方法的须要，对仪器条件，标准系列和样品参数等内容进行相关参数的设置。然后点测量。测量完毕后，将载流液和还原液换成蒸储水，点击清洗程序,对管道行两次清洗。全部操作完成后，点击熄火，将原子化炉熄灭后，退出软件,关闭原子荧光光度计主机电源及电脑，打开蠕动泵压块，放松泵管。2.1.2.2结果计算按式
11、(1)计算试样中待测元素的含量：Xi=(Ci-CiO)V/m1.OO(1)式中：Xi：试样中元素的含量，单位为哈克每克(mg/kg)：Ci：从标准曲线上查得试样溶液中各被测元素的浓度，单位为微克每升(g/1.)：Cio：从标准曲线上查得空白溶液中被测元素的浓度，单位为微克每升(g/1.)；V：测试溶液的体积，单位为亳升(m1.)；m：试样的质量，单位为克(g)o2.2中药防治鸡汞中毒的试验探讨2.2.1汞致试验鸡半数致死量1.D50的测定（1）致死量的确定按汞的国家标准值（HgV0.05mgkg）的6000倍剂量：（300mgkg）给药，视察4h,筛选出致死剂量。（2）半数致死量的确定以致死剂
12、量起先，往下按0.7倍的递减剂量分组，相邻两个剂量的对数之差相同。试验先从大剂量起先，于第一只动物用药后，假如发生死亡，在表中以f记录，下一只动物就降低一级剂量给药：相反，假如动物存活，下一只动物就用高一级剂量。依此类推。最终一只动物，虽未进行试验，但在表格内仍占位置，以符号表示。一般以出现不死剂量的向前于第2个死亡剂量为起始剂量，于第一次出现不死剂量为中心剂量。依据1.D50公式（1.D50=Ig-ICn（mgkg）计算出半数致死量2.2.2试验性鸡汞中毒最佳剂量筛选从购买的健康鸡苗中，选取体重匀称的32只，随机分为4组，每组8只，分为4组：1/161.D50、1/81.D50、1/41.D
13、50、1/21.D50、空白比照组仅喂基础日料，自由饮用自来水；试验组喂（基础日粮+1/16U）50）、（基础日粮+1/81.D50）、（基础日粮+1/41.D50）、（基础日粮+1/21.D50）,自由饮自来水。视察临床表现，或验期共计15天。于第15d后，宰杀试验鸡，采集血液，检测血清中生化指标;取其肝脏、肾脏、脾脏视察病理学改变。2.2.3中药最适剂量筛选2.2.3.1中药制备把打算好的中药饮片装入粉碎机进行粉碎，然后过100目筛，以阶梯安排法，匀称的混在饲料中，备用。2.2.3.2中药剂量筛选从购买的健康鸡苗中，选取体重匀称的32只，随机分为4组，每组8只，分别为每天2g中药/只、每天
14、4g中药/只、每天6g中药/只、每天8g中药/只、空白比照组仅喂基础日料,，自由饮用自来水；试验组分别喂（基础日粮+2g中药+36mgkgHgC1.2）、（基础日粮+4g中药+36mgkgHgC1.2）、（基础0+6g中药+36mgkgHgC1.2）、（基础日粮+8g中药+36mgkgHgC1.2）,饮用自来水。视察临床表现，试验期共计15天。15d后，宰杀试验鸡，采集血液，检测血清中生化指标；取其肝脏、肾脏、睥脏视察脏器指数改变。2.2.4防治试验动物分组与处理从购买的200只脱温鸡苗中选出健康、体重大小与个体差异均衡的鸡苗72只，随机均分为3组,每组24只，分别设空白比照组，阳性比照组和中
15、药治疗组。空白比照组饲仅喂基础日粮；阳性比照组喂（基础日粮+36mgkgHgC1.2）；中药治疗组喂（基础基口粮+6g中药+36mgkgHgC1.2）,各组自由饮用自来水，分笼常规饲养，试验期共计60d,试验期内视察试验鸡的临床表现。2.2.5防治试验样品采集与处理试验于第20d、40d、60d时,分别禁食12h,每组随机选取8只鸡称重，采纳颈动脉采血法采集血液，将血液分别装入无添加剂与有添加剂的采血管，并作记录。无添加剂管在室温下静置30分钟，2000-3000转/分别心30分钟，收集上清液并分装后置-80C保存，用于SOD、GSH-PX.AST及MDA的测定：有添加管血液采集后，在6h内进行血细胞成分分析。采血后，鸡只颈总动脉放血处死，分别肝、脾、肾等脏器，剔除脏器表面的脂肪和筋膜，用滤纸吸净表面的血液后（心脏处理：在大血管出入处剪断血管，用滤纸吸取心脏内残血），电子天平称量各脏器重量（左右肾合并称重）。脏器称重后，取5mm511m311m的肾脏、肝脏等组织块置于10%福尔马林磷酸盐缓冲液中固定。剩余组织器官分别装入已编号的聚乙烯那料袋中，置于-20C保存测定汞含量。2) 2.6汞对试验鸡部分脏器指数的影响取试验动物肝脏、脾脏、肾脏，并称重，记录。用下式进行计算：脏器系数=脏器重（g）/体重（g）2.2.7病理组织学切片制作（1）取材及固定：将取出
