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1、RT-PCR法分型检漓登革病毒核酸标准掾作程序I目的登革热患者和/或媒介伊蚊标本中病毒核酸的提取及PCR分型检测.2适用范圉适用于患并血标本及其传播媒介标本的检测。3检测的环境条件在标本中提取登革病毒RNA的实验要求在BS1.-2实验室操作，PCR分型检测在专门PCR室或区域操作。4实喇*4.1 实验准备4.1.1 在标本中提取登革病毒RNA要求在BS1.-2实验室，PCR分型在综合实险室独立区域或专门PCR室操作.4.1.2 进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂，样品。预约实验场所,并看前一位实验者是否已经清场。4.2 RNA的提取4.2.1 使用Q1.AamPVira1.RNAMini试
2、剂盒提取血清标本中病毒RNA4.2.1.1 吸取5601.包含我体RN,的AV1.缓冲液至1.5m1.的离心管中。4.2.1.2 向上述的液体中加入14(Hd样品，脉冲涡旋式混匀15秒，室温孵育IO分钟,简单离心使离心管顶端液体落到底部.4.2.1.3 在样品中加入5601.96100%的乙醉，混匀15秒，再简单离心O4.2.1.4 小心将6301.液体加入未浸湿的QIAamP小柱中，盖好盖,离心8(XX)rpmminIn1.in,弃去收集管，将柱子置于新的2m1.收集管上。4.2.1.5 打开Q1.AamP小柱的盖了、重史步骤6,直至样品全部离心。4.2.1.6 打开盖子，向柱中加入5001
3、.AW1.缓冲液，盖好盖，离心SOOOrpWminImin,弃去收桀管,将柱子置了一新的2m1.收集管上。4.2.1.7 打开盖子,加入5001.AW2缓冲液,盖好盖，离心14,OOOrpnVmin3min421.将柱子置于一新的2m1.收集管上，空离ImirKh.符柱子置于一新的1.5m1.离心管上，加入501.AVE洗脱缓冲液，室温孵目1 min.离心X(XX)rpnninImiiu4.2.2RNcasyMiniKit提取媒介组织标本或血液标木病毒RNA4.2.2.1 从Ki1.中取出R1.T液，根据标本数量分装适量:R1.T分按照I：100体积比分别加入小维基乙醉，分装至相应的预先标记好
4、的做垃离心管中，每管6(Xj1.o4.2.2.2 将150PI组织研磨混悬液分别加入相应的R1.T液管中，充分混匀。422.3混匀后依次加入75()1.70%的乙醉，充分混匀.4.2.2.4 从Kit中取出带收集管的滤柱，打开包装将其做好标记。取步.骤2中的混合液7501.加入滤柱中，12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。4.2.2.5 滤柱仍放回收集管上，将步骤2洞余的混合液全部转入灌柱中，1.2000rpm,熟心15s,弃离心液：4.2.2.6 于滤柱中加入700dWashBuffbrRW1.液，12000rpm,离心15s。4.2.2.7 从QIAGENRNeaSyMiniK
5、it中取一支干净的2m1.收集管，将离心后的灌柱移到新的收集管上，加入5()01.WashBufferRPE液，1.2(XX)rpm,离心15s64.2.2.8 弃收集管中的高心液，再于浦柱中加入50()1.WashBufferRPE液，13000-14(KX)TPm,离心2min。4.2.2.9 招漉柱移到一个无RNA标的干净的ISm1.cppcndorf管上，向港柱中加入30501.的RNaSC-freeWater,室温静置1.-3min,4.2.2.10 12000rpm,离心Imin,离心液即为病出RNA,立即检测或-70以下保存。43常规半套式RTPCR方法检测登革病毒核酸4.3.1
6、 用物：引物序列见下表引物序列片段大小D1.Si-Tcaatatgctgaaacgcgcgagaaac511CG-3,D25,-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-31511TSI5-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3,482(DI+TSI)TS25-CGCCCAGGGCCTGCG-3119(D1+TS2)TS35,-taacatcatcatgagacagagc-3,290(DI+TS3)TS45-ctctgttgtcttaaACAAGAGa-3,392(D1+TS4)4.3.2 PCR扩增根据实验室内所使用病毒核酸PCR扩增试剂盒特点，正向引物D1.和反向引物
7、D2配置第一轮PCR体系，进行第一轮PCR扩增。推荐反应条件为融预变性2min,然后94C变性30秒.55退火30秒，72延伸I分钟，反应40循环，圾后72延伸IO分钟。第二轮分型PCR扩增体系配置采用正向引物D1.与反向引物TSI、TS2、TS3和TS4。推荐反应条件为94预变性2min,然后94变性30秒，55退火30秒,72延伸1分钟,反应30循环,最后72C延伸1()分钟。4.3.3 1.5%浓度琼脂糖电泳分析，确定病毒型别“4.3.4 结果判读4.3.4.1W性：I型：电泳显示略小于50ObP的DNA片段。2型：电泳显示略大F1.OObp的DNA片段13型：电泳显示略小于30ObP的
8、DNA片段。4型：电泳显示略小于40ObP的DNA片段。43.4.2 阴性：无特异性核酸片段扩增。43.4.3 义阳性结果可以确诊登革病毒感染，可用丁登革热早期诊断.4.4实时定量RT-PCR法分型检测登革病毒核酸4.4.1 引物与探针引物/探针序列荧光标记DEN-I8973FCAGGAGTCGTGCADEN-I9O84CCtgagtgaattctctctactgAACCDEN-I8998p11)bcCatgtggttgggagcacgcFAMBHQ-IDEN-2I443FDEN-2I518CDEN-2I469probcCAGGrrATGGCAcTGTCACGATCcatctgcagcaaca
9、ccatctCCtctccgagaacaggcctcgaCTTCAAHEX/BHQ-IDEN-3740FDEN-38I3CDEN-3762probeGgactggacacactgcacttcaCATGrCTeTACerccGACrrGTCAcctggatgtcggctgaaggAGCTTGTCSaSRCd,BHQ-2DEN-4904FDEN-4992CDEN-496()probeTtgtcctaatgatgctggtcgTccacctgagactccttccaTTCeTACTCcTACGCATCGCATTCCGCy5,BHQ-34.4.2 实时荧光定RT-PCR扩增灰时荧光定量RT-PCR扩增
10、反应配置体系，参考如卜，RNA模板5g的0.51.,缓冲液12.51.,引物各0.51.（共4对.8条），探针各O251.,加水至总体积251.0推荐反应条件为5OC3Omin,950C2min.950C15s,6（）oC30s反应40个循环。4.4.3 结果判断以荧光PCR反应的前315个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阀值时所对应的循环数为循环间值（Q值），以C35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性O4.4.4 意义是一种灵敏、特异、低污染的登革病毒RNA检测方法，可以定性或定量检测登革热患者血清或蚊媒标本中的登革病毒.
