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1、人函台干细胞的探讨进展周进学号10170807【摘要】干细胞（StemCe1.I）是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞（Embryonicstemce1.1.s,ES细胞）是一种早期胚胎内细胞innerce1.1.mass,ICMJ或原始生殖细胞（primordia1.germce1.1.,PGCJ经体外分化抑制培育，别离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分他胞.人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学探讨的更大突破,提示了人体发生开展奇妙的进程,可能为现代1临床医疗模式带来革命性的变更.现对人类胚脑干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问鹿作一综述.【关键
2、词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述1、胚胎干细胞的概念胚胎干细胞是从哺学励物早期胚胎内细胞团（ICM）或桑植胚别离出来的、能在体外长期培育的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型牒S织细胞.胚胎干细胞属全能干细胞.ESCs这一名词因其来源于胚胎而得名，但从探讨角度来说I其概念始终没有一个特另助标准2001年美国国立卫生院依据AUStinSmith对小鼠ESCS的探讨，概括了ESCs的一些根本特征对其概念提出了一系列标准1：、来源于内细胞团或曩胚上胚层；、能第无限地进展对称分察并保持未分化状态（长期自我更新）；、显示并维持正常、完整（二倍体）和稳定的染色体核型
3、；、全能的ESCs能够分化成三个胚层（内胚层、中胚层、外胚层）来源的全部细胞类型,、在发育过程中能整合到全部胚胎组织中（体外经长期培育的小鼠ESCs1被植入另一胚胎形成嵌合体动物后，仍能产生全部组织）；、具有能克隆形成胚胎细胞系的实力，并能产生卵子或精子细胞；、基因克隆，即一个单一的ESCs能产生一群具有一样遗传特性的细胞（克隆）,这些细胞有若与亲代细胞一样的特征；、表达转录因子OCt-4,后者继而激活或抑制大量的靶基因，以使ESCS维持未分化状态；、可被诱导而接若培殖或进入分化状态；、缺乏纽胞周期中的G1.期的限制点。ESCs大局部时间都处于细胞周期的S期，在此期进展DNA合成。与已分化的体
4、细胞不同,ESCs不需任何外界剌激来启动DNA的复制.其中、不适用于人的EGCs,和不适用于人的ESCs,全部的标准都适用于小版的ESCs.2、胚胎干细胞的获得途径及其多能性目前胚胎干细胞的荻得途径主要有2个:一是从自然胚胎中获得,可在胚胎发育的不同阶段获得;二是通过细胞克隆得到的胚胎中获得,也可在胚胎的不同发育阶段获得.随百克隆技术的开展,后者显得更为简单.胚胎干细胞的多能性表现在它具有多种分化发育的潜能.其多能性学术上用两个词来加以区分:全能(totipotent),即指受希卯及鹭胚细胞所具有的实力.除具有分化为机体全部纽胞类型的潜能外,还有形成完整生物体的潜能;多能(PIUriPOten
5、t),即指从内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(又称胚胎生殖系干细胞)桁生而来的细胞或细胞株所具有的实力，能形成包括生殖系在内的全部组织类型但形成一个完整的生物体的可能性很小.3、胚胎干细胞探讨的主要物种类型3.1人类目前全世界已取得了60余种不同基因的胚胎干细胞系,主要分布在美国、澳大利亚、新加坡、印度及以色列等也由于助孕技术中的超促排卵及体外受精2胚胎移植(试管喔儿)技术的不断成熟和在世界各地的快速开展.人胚胎干细胞的来源显得比其他物种更为简单和丰富,同时因为探讨的干脆性而为广袤学者所重树但由于法律和伦理的缘由,胚胎干细胞的探讨将受到诸多的限制.3.2灵长类灵长类动物与人的关系亲密且没有太多
6、法律与伦理上的限制,所以灵长类胚胎干细胞是目前探讨最多的胚胎干细泡种类,以恒河撅与娟猴为代表2.恒河猴与人类的关系最为亲密,在生殖与生长发育过程中与人有很多相像之处因此是胚胎学探讨的最正确模型,恒河猴胚胎干细胞也就成了了解各种人体组织分化的很好的体外模型,但其生殖特性(性成熟晚、妊娠期长、单胎孕育等)限制了其应用;绢猴为西半球灵长类动物,与人类的关系不如恒河猴近,但因其生殖特性在试验中获得了广泛的应用.绢猴一般是多胎孕育性成熟期只有18个月,妊娠够短,更生要的是绢猴的卵荣周期可以在前列腺素的调整下同步化,这就可能收集到大量生长发育一样的胚胎.目前,绢猴胚胎干细胞为我们供应了一个了解灵长类胚胎移
7、植和妊娠型系识别的特别生要的模型.从恒河喉与绢猴胚胎中别禽出的胚给干细胞均具有其特有的一套特异性标记物,它们包括阶段特异性胚胎抗原3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子糖蛋白TRA-I-60和TRA-I-81、性磷酸酶等.这些标记物与标记人胚蛤性癌细胞(embryona1.carcinomace1.1.s,EC细胞)的外表抗原一样.这说明灵长类与人类在胚胎学上有高度的相像性而瞌胚胎干细胞仅表达SSEA-I与碱性磷薮的活性,说明胚胎干细期外表标记物具有物种差异.3.3小鼠(mouse)由于历史上的广泛应用及已明白的遗传学机制和多产特性,使小鼠成为哺乳动物胚胎学的主要探讨对盆.世界上最早的胚
8、胎干细胞株就是首先从小鼠胚船中别旖出来的。胚胎干细胞别离及培育的方法学也是由此建立并开展起来的.对小鼠胚胎干细胞做进一步探讨有助于灵长类及人类胚胎干细胞探讨的开展.3.4其他如鱼、鸟、兔、猪等肖椎动物中亦能别离出多能胚胎干细胞株.胚胎干细胞探讨物种的多样化对于探讨生物体的早期发生过程是特别必要和重要的,如细胞的谱系定型和里组基因印迹等,对基因修饰及核移植技术的探讨和开展也有更要的作用.4、胚胎干细胞的别离与增殖技术以从灵长类胚胎ICM中别黑灵长类胚胎干细胞为例3J简述如下.4.1 别患ICM前的打算打算小鼠原始成纤维细胞层.将小鼠原始成纤维细施用30Gy的Y-射线处理,使它终止有丝分裂活动,以
9、5104个/cm2的密度置于用0.1%动物股处理后的组织皿中,参与培育液(80%DMEM,20%胎牛血潦0.1mmo1./1.22造基乙即和1%非必需氨基酸溶液),三5%CO2温箱中静育过夜.4.2 别寓ICM将排卵后6d的恒河喉詈胚(g三卵后8d的绢猴量胚)放入0.5%DMEM中孵育,至透亮带裂刑寸马上将寰胚移入含兔抗恒河猴脾细胞(或兔抗绢猴脾细胞)抗体的DMEM中新音30min,经DMEM冲洗后再移入1:10的几内亚猪补体中30min,再经DMEM冲洗后,用吸管吸除ICM中的滋养层细胞,最终将ICM种植在词养层上.4.3 胚胎干细胞的培育和增殖种植7IOd后,将ICM来源的细胞团移入含0.
10、05%胰蛋白的的EDTA中35min,用吸管轻轻吹打使它散开,将细胞种植到新培育基上.细胞集落形成后,再将单个细胞别离出来种植到新培育基上如此反复,7：1.Od进展1次.4.4 胚胎干细胞的冷冻保存如须要将胚胎干细胞冷灰最好在培育早期迪此选择细胞形态及核型均正觉的纽胞冷灰并在液氨中长期保存.4.5 5操作考前砌(1)定期将未分化的细胞集落从已分化的细胞中别离出来并种植到新的培育基上;(2)转移细胞时尽量快以免细胞发生解君和死亡;(3)别寓细胞集落时使每个局部含510个细胞否那么细胞过多将导致分化,细胞过少那么克隆的效率低;(4)由于胚胎干细胞是对各种内毒素最为敏感的细胞.故要重视培育液和血清的
11、质0；(5)重视原始成纤堆细胞的质量,没有原始成纤维细胞全部的胚胎干细胞将在7IOd内分化或死亡,假设原始成纤维细胞质量差超蚣不能有效地抑制胚胎干细胞的分化而导致培育增殖失败.总之胚胎干细胞的别离与培育是极其困雉的膜室技术,目前的培育条件将不能防止胚胎干细胞的分化而且随若培育周期次数的增多,胚胎干细胞的稳定性也会下降.因此,如何改良培育条件和培育技术是胚胎干细胞探讨中最全要的问题。5、人类胚胎干细胞的来源主要有：Q)从人类胚胎的鳗胚期内细胞群中干能别盅多能干细胞4;(2)从终止妊娠的胎儿组织中别离出多检干细胞体细胞核转移(Somaticce1.1.nucIeartranspIantationz
12、SCNT).6.人胚胎干细胞系的建立1989年Prea尝试从人峋胎瘤别离ES细胞,初步证明白人ES细胞系建立的可能性.1998年Thomson领导的小组将合法获得的体外受筠的人早期胚胎在体外培育至囊胚期,利用免疫外科手术去除透亮带,以抗BeWO纽奥的单抗作免疫标记制除外层细胞,以35Gy射线照耀小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层,以DMEM+胎牛血清+谷色酹肢+筑基乙醇+非必需冢基酸作为培育源体外培育人寰胚内纽胞群,915d后将长出的细胞团次散或者用腹能或EDTA消化,然后接着在小鼠滋养层细胞上生长,选择具有均一的未分化形态的单克隆细胞团,吹散成50100个细胞的锄后再行培育,如此生豆豆至成系。在此期
13、间每一步都需视察知胞染色体核型以确定它未癌变.此后细胞系经吹打或胶原反IV处理长期传代.倜口从14个暖胚中,最终建立起5个人类ES细胞系:H1.、H13.H1.4、H7和H19.这些细胞系接若培育56个月传32代仍可接着生长6.Gearhart领导的小组采纳了与Thomson小组不同的方法Z从59周龄流产胎儿的性腺螭(gonada1.ridges)及肠系膜中别离原始的干细胞(PrimordiaIgernKe1.1.S,PGCs),命名为EG细胞.以期防止因干脆利用胚胎所造成的伦理学上的麻烦,将EG细胞体外培育于小鼠成纤维细胞层上,培育体系中参与重组人1.IF,重组人碱性成纤维细胞生长因子及Fo
14、skoIinJ21d后形成较大的多细胞集落,其形态与小鼠EG或ES细胞集落相像.经过一系列与Thomson试脸室相燥的免疫组化及功能试险证明获得了可成系的人胚胎干细胞集落.迄今为止,除ThomSon、Gearhart和Shamb1.ott等的报道外,人ES细胞别离尚无胜利报道,主要缘由是人ES细胞建株的条件尚不成熟,而对人ES细胞体外诱导分化的探讨至今尚无报道.7、胚胎干细胞的应用前景及主要问俄由于胚胎干细胞的高度爰制实力及多向性分化的潜能,已展示出很好的探讨、应用前景.如将特别变更的基因转导至ES细胞中,体外选择后将ES纽胞导入机体,使ES中的遗传信息传达给子代可检有助于克制诞生缺陷,订正某
15、些遗传性疾病8；将经过基因修饰过的ES或EG细胞与正常细胞放在一起形成嵌合体,探讨发育进程中细胞与细胞之间相互作用对细胞突变的影晌;将ES或EG细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入,探讨特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿痛形成的影响等Q0121.最近有人用RNAi的方法使hES细胞中某个基因表达下降,荻得较稳定的结果13。科学家们认为有希望通过该方法创立免疫无反响的hES细胞系,从而限制hES细胞移植后的排斥反响,使hES细胞移植易于胜利。人胚胎干细胞探讨有望为目前临床某些难治性疾病供应治疗的新方法甚至治愈的可能性,如可将hES体外透导分化的心肌细胞导入心室壁,替代己梗死的心肌功能14;应用
16、体外分化的胰岛细胞治疗1型穗尿病;应用诱导分化的神经细胞前体细胞治疗帕金森病.有人预言,将来可应用胚胎干细胞在体外形成的官取代功能衰谒的体内器官,为器官移植供应垂要的来源保障.当然要实现胚胎干细胞的临床应用,还要做很多工作:须要探讨说明胚胎干细胞基因组印迹状态(genomicimprinting),基因组ED迹是某些等位基因的表遗传修饰,与胎儿发育异样及0帆生长有关.在个体发育不同时期,基因组印迹状态不同。己有探讨说明,鼠胚胎干细胞基因组Ep迹异样或不稳定;但另一组探讨者那么发觉人和小鼠EG纽胞的基因组印迹根本正常,这可能为胚胎干细胞临床应用解除了一大酹碍.但对hES细胞的探讨尚未见报道.须要解决免疫排斥问题,探讨说明,与其他同种异体的组织器官移植相比,虽然hES、hEG细泡移植的排斥反响较隹但它仍不行防止地会发生.供者与受者ABo血型抗原、
