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1、第四章第四章 新药临床前毒理学研究新药临床前毒理学研究 （Toxicology Study before Clinic）第一节第一节 研究目的和意义研究目的和意义1、研究意义 n使上市新药在临床治疗剂量下无毒，提高临床使用的安全性安全性。n成功的例子： 如青霉素致敏导致许多病人死亡后，人们便进行多方面的深入研究，了解到引起过敏反应的机制是由于青霉素在人体内遇到蛋白质等物质后，生成青霉素酸等半抗原，找出了与人类有同样反应的动物模型豚鼠，建立起检测这类药物的致敏方法 。 2、局限性nWHO在临床前药物安全实验原则一书中指出：“虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的科学研究，但给人使用仍总是不可避
2、免地冒一定风险”。n造成风险的原因主要来自两方面：一方面是新药本身；另一方面来自毒理学研究手段。（1）新药本身新药本身：n不断改变化学结构和由之而产生的药理学特征，往往超出人们原有的知识，超出经验和研究手段所达到的预测能力。 （2）毒理学研究手段毒理学研究手段（动物毒性实验）：n实验动物和人为药物反应的种属差异；n实验动物的数量有限，那些发生率低的毒性反应，在少量的动物中难以发现；n常规毒性试验所用的动物多系实验室培育的品种，反应较单一；n毒性实验所用的动物都是健康的，而临床用药的病人则可能同时患有多种疾病；n动物毒性试验中采用大剂量的做法与临床用药相差甚远，特别是那些毒性低、给药量很大的药，
3、有时会给实验结果造成假象。3、内容和要求、内容和要求 （1）内容： 急性毒性研究（Acute toxicology） 长期毒性研究（long-term toxicology） 特殊毒性研究（Special toxicology Test） 其他相关毒性研究（2）要求：n 1给出毒性剂量给出毒性剂量 不仅要测出急性毒性的LD50，使我们粗浅了解该药单次给药的毒性剂量，还要了解连续长期给药产生毒性的剂量。n 2确定安全剂量范围确定安全剂量范围 要知道单次或多次给药在多大范围内不仅有效(主要药效学)而且不产生毒性和不良反应，安全范围越大，则作用越好。n3发现毒性反应发现毒性反应 通过动物的毒性反应症
4、状为临床用药的安全性监护提供依据，预防毒性和不良反应的发生，一旦发生便可及时采取措施。n4寻找毒性靶器官寻找毒性靶器官 它不仅能为药物毒性防治提供依据，还有可能为开发新药提供线索。n5判断毒性的可逆与否判断毒性的可逆与否 动物出现毒性反应，必须搞清能否恢复，一般来讲，可逆性毒性反应不影响新药注册，如有不可逆性损伤，则一般不批准上临床。n6解救措施解救措施 特别是作用强而猛、安全范围小的药物。第二节第二节 急性毒性试验急性毒性试验（ Acute toxicology ）n1、定义： 指动物一次或24小时内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。 n2、方法： 定性观察定性观察：观察服药后动
5、物有哪些中毒表现，其毒性反应出现和消失的速度如何，涉及哪些组织和器官，最主要的可能毒性靶器官是什么，损伤的性质及可逆程度如何，中毒死亡过程有哪些特征，可能的死亡原因是什么等。定量观察定量观察：观察药物毒性反应与剂量的关系，主要指标有近似致死剂量，半数致死剂量和致死剂量，其中以LD50为主要定量指标(小动物) 。相相 关关 名名 词词n最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受试对象死亡的最高剂量。n最小致死剂量（Minimal lethal dose, MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量 。n半数致死量（Median lethal dose, LD50
6、）：在一定试验条件下引起50%动物死亡的剂量。该值是经统计学处理所得的结果。n未见反应剂量（No observed effect level, NOEL）或未见不良反应剂量（No observed adverse effect level, NOAEL） 一、作用意义一、作用意义n1了解新药急性毒性的强度 n2可计算新药相对毒性参数n3为临床毒性不良反应提供参考依据 n4为长期毒性、蓄积性毒性和特殊毒性试验选择剂量提供依据 n5其他方面：系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也须参考LD50，看生物效应有无明显差别，以抑制药物转运 二、基本内容和要求二、基本内容和要求(药物非临床研究质量管
7、理规药物非临床研究质量管理规范范)n1动物动物 应符合国家有关规定的等级要求，并具有实验动物质量合格证 q种类：啮齿类和非啮齿类各一种；q体重：小鼠体重1822g，大鼠体重120150g，同次试验体重相差不超过20；q健康、成年 ；q性别：雌雄各半；q动物数：一般原则是使用尽量少的动物数，获得尽量多信息。n2.受试物受试物q急性毒性研究的受试物应能够代表临床试验受试物和上市药品，与临床试验受试物和上市药品符合同一质量标准。q如果受试物为复方制剂，建议进行各成分单独给药的试验和按复方制剂比例联合给药的试验，以提示有无增毒作用，或是否出现新的毒性。q如果受试物在贮存条件下易发生降解，建议以含降解产
8、物量最高的受试物进行急性毒性试验，并与临床样品的急性毒性试验结果比较。 n3.给药途径给药途径 q一类药及可溶于水的至少须两种给药途径，其中一种必须是临床给药途径，和一种能使原型药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。q其他类至少有一种临床给药途径。 n4剂量和分组剂量和分组 q给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性 (危及生命的) 剂量，同时设阴性对照组（溶剂对照组）。q一般用不等浓度等容量不等浓度等容量给药， 见P45，表4-2：急性毒性试验不同动物给药途径相对应的常用容量和最大容量。q小动物一般分46个剂量组。各剂量组组距一般以0.65-0
9、.85为宜，具体根据药物毒性大小和预试结果而定。大动物可用50等量递升法，一般用6条犬。n5观察记录观察记录 q给药当天，尤其是给药后4h内应严密观察并记录，然后每天上、下午各观察记录1次，至少连续观察14天。q观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。q记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。n6剖检剖检q对于所有的试验动物均应进行大体解剖，包括实验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活而处死的动
10、物。q任何器官出现体积、颜色、纹理改变时，均应记录并进行组织病理学检查。 n7结果处理结果处理 实验资料按表所列项目填充，用适宜统计方法计算LD50值。若发现毒性反应有明显性别差异，则应分别求它们不同性别的LD50 。 *FDA不要求LD50。 *在ICH会议上，认为LD50不再是急性毒性试验的一般要求了，急性毒性研究的重点是暴露动物在死亡之前出现的毒性及其与剂量的关系。 *但是对于毒性较大的动物及细胞毒类的抗癌药物，推算期临床的起始剂量时，要求提供准确的LD50值。 n8MTD测定（最大给药量法）测定（最大给药量法）q当有些药物用最大允许浓度和最大允许容积给予动物，仍未测出LD50时，可只求
11、MTD值。即用最大浓度和最大允许容积一次给药于20只动物后，连续观察714天，未见任何动物死亡，则MTDg/kg。若仅有个别死亡，则宜写成LD50g/kg。第三节第三节 长期毒性试验长期毒性试验 (long-term toxicology）一、定义和目的一、定义和目的n1、定义：、定义： 指反复多次给药于动物，观察药物对动物的毒性反应，一般是指连续给药14天以上。n2、目的：、目的： 通过重复给药的动物试验表征受试物的毒性作用，预测其可能对人体产生的不良反应，降低临床受试者和药品上市后使用人群的用药风险。n3、内容(最终落实目标)： 发现受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、
12、量效和时效关系、可逆性等； 判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织； 推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全范围； 提示临床试验中需重点监测的安全性指标； 对毒性作用强、毒性症状发生迅速、安全范围小的化合物，长期毒性研究还可以为临床试验中的解毒或解救措施提供参考。二、动物毒性反应对于临床试验的意义二、动物毒性反应对于临床试验的意义 n长期毒性试验是动物非临床安全性评价的核心内容，是能否过渡到临床试用的主要依据，也可为临床安全用药剂量设计提供参考依据，并为临床毒性和不良反应的监护及生理生化指标检测提供依据；n动物长期毒性研究的结果一般不会完全再现于人体临床试验。但如果没有试验或文献依据证明受试物
13、对动物的毒性反应与人体无关，在进行药物进行药物评价时必须首先假设人最为敏感，长期毒性研究评价时必须首先假设人最为敏感，长期毒性研究中动物的毒性反应将会在临床试验中再现中动物的毒性反应将会在临床试验中再现。三、基本内容和要求三、基本内容和要求1. 动物动物 理想的动物应具有以下特点： 对受试物的生物转化与人体相近；对受试物敏感；已有大量历史对照数据。 n要求两种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬或猴。n性别要求雌雄各半。n一般大鼠为雌、雄各10 - 30只，Beagle犬或猴为雌、雄各3 - 6只。 2. 饲养管理饲养管理n饲料应写明供应单位，若自己配的饲料应提供配方及成分含量的检测报告。n各种
14、实验动物均应在符合GLP要求的动物房内饲养。n动物室内温度、湿度、光照和通风条件均应写清楚。n笼养大鼠每笼不宜超过5只，雌雄分开，有条件时单笼饲养，实验前至少适应观察1周。食量每天记录，体重每周称1次。犬宜单笼饲养，定量喂食，Beagle犬实验前至少训养2周，用标准饲料喂养。杂种犬要预先检疫、驱虫，实验前至少驯养1月。猴实验前驯养1月，用标准饲料喂养。 3. 受试药受试药q受试物应能够代表临床试验受试物和上市药品，与临床试验受试物和上市药品符合同一质量标准。4. 给药途径给药途径q一般要求同临床给药途径；q临床静脉注射(大鼠)时可用腹膜内注射代替，i.m.或s.c.可变换注射部位，特殊情况另作
15、说明。 5. 剂量及分组剂量及分组n一般设4个剂量组，剂量以mg/kg或ml/kg为计量单位。n一般以不等浓度等容量不等浓度等容量给药。qa.低剂量组：目的是寻找动物安全剂量范围，为临床剂量设计作参考，一般应高于整体动物有效剂量，此剂量下应不出现毒性反应；qb.中剂量组：应使动物产生轻微的或中度的毒性反应；qc.高剂量组：目的是为寻找毒性靶器官、毒性反应症状及抢救措施提供依据，也为临床毒性和不良反应监测提供参考，应使动物产生明显的或严重的毒性反应，或个别动物死亡；qd.空白对照组：溶媒或其他赋形剂。n若所用溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组，每组大鼠雌雄各10只，3个月以上应增加到雌雄各20
16、只，用大动物时每组雌雄各2只，大剂量组宜各3只。6. 给药期限与给药频率给药期限与给药频率1.给药期限：给药期限：q给药期限为2周的长期毒性研究通常可支持临床疗程1-3天的药物进行临床试验和生产；q给药期限为1个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程2周的药物；q给药期限为3个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程4周的药物；q给药期限为6个月的长期毒性研究通常可支持临床疗程1月以上的药物。2.给药频率：给药频率：q原则上长期毒性研究中动物应每天给药；但给药周期为3个月或3个月以上：可采取一周6天给药。 7. 检测指标检测指标na一般观察：外观体征、行为活动、摄食量、体重、粪便性状、给药局部反应等。nb血液学指标：红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白(Hb)、白细胞总数及分类、血小板、凝血时间。 nc血液生化指标：天门冬氨酸氨基转换酶(AST或SGOT)、丙氨酸氨基转换酶(ALT或SGPT) 等。nd病检器官 (1)系统尸解应全面细致，为组织学检查提供依据。(2)脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胸腺、睾丸、子宫、脑和前列腺。(3)组织学检查 对照组、高剂量组及尸检异常时要详细检查，其
