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1、第七章第七章 现代生物学技术在蛋现代生物学技术在蛋白质工程中的应用白质工程中的应用 传统技术：传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、技术、酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISA）新技术：新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；用于功能蛋白质筛技术、蛋白指纹图谱技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术选的表面展示技术 第一节第一节 表面展示技术表面展示技术 运用运用 DNA 重组技术在重组技术在噬菌体、细菌、真菌、噬菌体、细菌、真菌
2、、病毒病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术术等方面得到了广泛应用。等方面得到了广泛应用。概念概念 表面展示技术是利用表面展示技术是利用基因工程基因工程手段将手段将外外源基因源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以以融合蛋白融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。体表面。 一、一、噬菌体展示技术噬菌体展
3、示技术 噬菌体展示技术噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与特是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。（如右图所示）。1985 年年 Smith 等首次应用了该等首次应用了该技术。技术。 1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬菌体的表面，并证实该蛋白有生物活性，可以被相应的抗体识别。随后，许多有功能的蛋白都被表达于噬菌体的表面，包括分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋白和酶类，为这些蛋白的基因工程改造奠定了基础。 从理论上讲，任何蛋
4、白只要能够分泌到细菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。 1990年，George等证明噬菌体不会因外源性DNA片段的插入而影响其本身的粘附、侵入及整合。这种带有外源性基因片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性基因产物和PIII的融合体融合壳蛋白，由于PIII的特殊定位，外源性片段得以在噬菌体表面表达，并同时保持了本身的三维结构和功能，进而使噬菌体成为一个理想的携带工具。Phage structure:Fiber structure 1 原理原理 具体来讲噬菌体展示技术就是将具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选待筛选基因基因插入噬菌体插入噬菌体信号肽序列信号肽序列与与主要衣壳主要衣壳蛋白基因（主要是基因
5、蛋白基因（主要是基因或基因或基因）之之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融融合蛋白合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的响噬菌体的完整性和活性。完整性和活性。 噬菌体展示载体噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图示意图pCANTAB 5E-scFv5243 bpg3 signalsfiIscFvNotIE-tagAmber stopfd gene3M13 oriAp噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。通量筛选的方法。其建立基于三个原则：其建立基于三个原则：I.在在衣壳蛋白基因衣壳
6、蛋白基因（主要是（主要是基因基因或基因或基因）的）的 N 端端插入外源基因，形成的融合蛋插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了干扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源外源蛋白的天然构象蛋白的天然构象，并能被，并能被相应的抗体或受相应的抗体或受体体所识别所识别 。II.利用固定于利用固定于固相支持物固相支持物的的靶分子靶分子，采用适，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；筛选出目的噬菌体； III. 外源多肽或蛋白质外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表
7、面，表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过可通过分泌型噬菌体分泌型噬菌体的的单链单链DNA测序测序推导推导出来。出来。展示文库的特点展示文库的特点 富集程度高，由此建立的展示文库的可达106-1012 位置明确，噬菌体的PIII蛋白定位特殊，定位于噬菌体的尾部，其氨基末端为噬菌体结合F纤毛 噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性 大部分的蛋白质都可在其表面表达 目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有：统有：丝状噬菌体丝状噬菌体展示系统展示系统 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 T4 噬菌体噬菌体展示系统展
8、示系统 T7 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 其中，其中，T7 噬菌体噬菌体系统可以系统可以高、中、低高、中、低拷贝展拷贝展示示不同分子量的蛋白不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展，是目前最为理想的展示系统。示系统。 单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统，主要用于获得高亲和力的克隆，形成单价表面展示体系 P VIII 展示系统，主要用于筛选亲和力较低的克隆，形成多价表面展示体系 P VI 展示系统 T4噬菌体展示系统 其病毒颗粒在宿主细胞内组装，不经过分泌途径，因而其表面展示多肽的范围更广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质 噬菌体展示系统（同上）可展示有活性的大分子蛋白（
9、100kDa以上）以及对宿主细胞有毒性的蛋白，在后基因组时代前景相当可观应用的基本原理应用的基本原理（Panning) 将已经建立好的噬菌体文库进行淘选 所谓淘选，是将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物的特异性的配体（或称靶分子）作为固定相，洗去不能与固定相特异结合的文库大部分成员，将特异结合的成员留下进一步扩增，并反复数轮淘选，即可将无用的基因去掉而将有用的基因富集并分离出来。Panningprocessing2 应用应用（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程）噬菌体展示技术与蛋白质工程 将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展示载体上，构成一个高容量的噬菌
10、体展示载体上，构成一个高容量的噬菌体多肽文库噬菌体多肽文库时，该文库可用于时，该文库可用于特异特异性功能多肽性功能多肽的筛选。同样，利用噬菌体的筛选。同样，利用噬菌体展示展示 cDNA 文库文库，可筛选出特定的，可筛选出特定的蛋白蛋白质或基因质或基因。 （2）噬菌体展示技术与抗体工程）噬菌体展示技术与抗体工程 噬菌体展示技术的出现使噬菌体展示技术的出现使抗体工程抗体工程进入进入第三次革命第三次革命。噬菌体展示技术的成功应。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令
11、人满意的并且修饰过和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。的抗体。 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage antibody library）。）。（3）生产高效低价疫苗 它能方便地大量生产疫苗用抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多个具有保
12、护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗。（4）研究诊断用疫苗 （两种情况）1 在抗原决定簇已知的情况下，构建重组噬菌体可以为血清学分析提供大量的抗原来源，因为它不需要裂解宿主细胞而直接分泌到培养基中；抗原制备纯化简单，成本低下；噬菌体颗粒稳定，易于长期保存；能在同一个噬菌体同时展示不同的病原体的抗原决定簇。 2 在预先不知道诊断用靶抗原的情况下，使用患者血清从抗原决定簇库中筛选出展示特异性抗原决定簇的噬菌体，这种噬菌体只能与病人血清抗体反应，而不能与正常人的血清反应，从而建立起疾病的特异性诊断方法。(5)筛选酶抑制剂 Norgren等利用该技术筛选到了7种酶系种的6种抑制剂，Dennis从肽库中筛
13、选到能非竞争性地抑制丝氨酸蛋白因子VIIa活性的肽段3 噬菌体展示技术的局限性噬菌体展示技术的局限性 (1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的过程，这就大大限制了所建库的容量容量和分子和分子的多样性。的多样性。 (2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合。作为噬菌体的宿主，转运、膜插入和络合。作为噬菌体的宿主，大肠
14、杆菌的生物合成系统有本身的表达限制，大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制，不能进行氨基酸的修饰，蛋白质的糖基化或不能进行氨基酸的修饰，蛋白质的糖基化或不能合成不能合成D型氨基酸。型氨基酸。(3) 噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。遗传的多样性。(4) 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。毒素分子，很难得到有效表达和
15、展示。(5) 从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性，成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性，这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。限性。二、二、核糖体展示技术与核糖体展示技术与 mRNA mRNA 展示技术展示技术 核糖体展示（核糖体展示（Ribosome display）技术与）技术与 mRNA 展示技术由于在展示技术由于在体外无细胞翻译体系体外无细胞翻译体系中进行，用中进行，用 mRNA 的可复制性，使靶基因的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率（蛋白）
16、得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量（10121014），而且能够增加表达的蛋白质），而且能够增加表达的蛋白质溶解度。溶解度。核糖体展示技术的基本原理核糖体展示技术的基本原理 核糖体展示技术的基本原理是通过核糖体展示技术的基本原理是通过PCR扩增扩增目的基因目的基因的的 DNA 文库文库，同时加入，同时加入启动子、核糖体结合位点及启动子、核糖体结合位点及茎环茎环，并置于具有偶联转录，并置于具有偶联转录-翻译的无细胞翻译系统中翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面。去孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面。去掉掉3端的终止密码子端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在从而成功地使核糖体停留在mRNA3末端末端,将蛋白质和将蛋白质和mRNA连接在一起。并形成连接在一起。并形成“mRNA-蛋白质蛋白质-核糖体核糖体”三元复合体，最后利用常三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用
