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1、HIV实验室诊断一、HIV的一些相关知识： 1. HIV的结构 2. HIV基因组成及结构 3. HIV感染的免疫反应二、HIV的实验室检查 1. 实验室、人员及设备要求 2. 实验室检测 3. 职业暴露1. HIV的结构脂质膜蛋白酶整合酶P18gp120gp41RNA反转录酶P24核蛋白核衣壳(由微粒组成)2、HIV的基因分型HIV可分为两个型：HIV-和HIV-。(1) 基因组成：: LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpuvpu-env- nef-LTR.: LTR-gag-pol-vif-vpxvpx-vpr-tat-rev-env- nef-LTR. 结构基因：
2、 gag、pol、 env 调节基因： tat、rev、nef、 vifvif、vpuvpu 附属基因： vpr、vpxLTPgagLTPgagpolpolvprvifviftat vpurevenvrevrevrevtattattatenvLTPLTPvprvpxnetnet（2）基因结构：(3) 两者的主要区别： 型含有vpuvpu，而型含vpxvpx。 vpr和nef与其他基因的关系也不同： A HIV-的vpr与vif相互重叠，而nef 与env不重叠； B HIV-的vpr与vif不重叠，而nef与 env相互重叠。(4) 基因表达产物： HIV- HIV- env：gp160 gp
3、120 gp41 gp140 gp105 gp36 gag： p55 p24 p18 p56 p26 p16 pol： p65 p51 p31 p68 p53 p343.HIV感染的免疫反应 抗-gp41抗-p24p24HIV抗体初筛检测程序：样本选用初筛试剂初筛检测阳性反应阴性反应原有试剂另一种原理初筛试剂重复检测均呈阳性一阴一阳均呈阴性 送确认阴性报告HIV抗体的检测：1.初筛试验方法及原理： （1）ELISA （2）明胶凝集试验 （3）金标法 （4）自动化仪器测定2.确证试验：免疫印迹法、间接免疫荧光法、免疫沉淀法 (1) 方法原理 (2) 确证试验结果判断：美国CDC：gp160/gp
4、120或p24/gp41 任意二条带美国FDA：gp160/gp120或p24、gp41、p31 三者 组合WHO：至少二条以上env带美国红十字：gag、pol、env每组至少一条带中国：至少二条以上env带或一条env带和一条 (gag)p24带。3 注意事项 (1) 相关的政策和规定 (2) 临床操作中的注意事项 (3) 初筛与确证结果的差异及解释 (4) 医疗纠纷1、HIV-1持续流行： 全球HIV流行和AIDS仍继续增加，尤其是MSM同性恋人群，多达50% HIV 传播发生在疾病急性和早期，（流行病学意义）2、高病毒RNA水平： 性传播感染仍具首位，生殖道 HIV RNA 水平相当于
5、血液中HIV RNA水平。高病毒载量、独特的病毒特性以及缺乏中和抗体，急性期感染者感染性极高。VL10 M copies/mm33、极易垂直传播： 怀孕妇女感染HIV，增加HIV垂直传播的危险。2013年4月全国报告的HIV感染者（5560例）中，母婴传播占1.3%；AIDS病人（2806例）中，母婴传播占1.0%。 为什么为什么HIVHIV急性感染（急性感染（AHIAHI）越来越受到重视？）越来越受到重视？4、应尽早尽快进行诊断： HIV感染急性期，感染者无症状和流感样症状而经常漏检而误诊，感染者本人不知自己感染状态，极易在高危人群中传播5、应尽早进行人群干预： 实时对感染者及其配偶、孕妇感
6、染者及其婴儿进行干预，知晓感染状态，减少危险性行为；了解和干预复杂的性传播网6、应尽早进行病毒干预： 在AHI时期进行可能的干预以限制HIV复制和整合入病毒潜伏池、（整合后不可治愈），早期抗病毒治疗的必要性(转变观念)7、指导疫苗研究： 基于急性期感染时期的传播性/奠基者病毒的特性8、建立人类自然模型： 研究AHI个体，为详细了解人类HIV传播事件提供最好的机会为什么为什么HIVHIV急性感染（急性感染（AHIAHI）越来越受到重视？）越来越受到重视？RNA+ Ab-P24+ Ab -血清阳转后的方法RNAp24Ab血清阳转抗体检测临界值 特异性抗体比例时间反应指标感染 血清阳转前的方法怎样检
7、测怎样检测HIV-1HIV-1早期感染早期感染? ?HIV血清阳转窗口期从感染HIV到抗体呈阳性反应这段时间血浆中含有高浓度HIV RNA有很高的传染性现在普遍认为2周3个月,个别案例达6个月。HIV感染各种检测方法的窗口期HIVAbHIVAb检测（第三代试剂）：窗口期约检测（第三代试剂）：窗口期约2828天天HIVAb/AgHIVAb/Ag联合检测（第四代试剂）：窗口期约联合检测（第四代试剂）：窗口期约1515天天核酸检测：核酸检测： 窗口期约窗口期约1010天天窗口期感染者的病毒学特征 病毒载量值范围为3.846.84Log10Copies/mL； 28例窗口期病例，病毒载量百万级有10份
8、（35.71%）；十万级9份（32.14%）；万级的样品7份（25%）；万级以下的样品2份，占总样品数的7.14%。HIV急性期感染或窗口期感染检测方法1.Ab/Ag联合检测: ELISA2.HIV RNA检测: 集合PCRHIV Ab/Ag联合检测检测早期HIV感染的效果与单独HIV-1抗原的试剂相当与RT-PCR方法相比，平均滞后时间是大约3.23天与第三代抗体试剂相比，窗口期缩短了1.56 到 5.32天检测献血员的特异性是99.80%第四代试剂的敏感性和特异性均有所提高HIV Ab/Ag联合检测试剂的原理HIV Ag检测：固相 血清 / 血浆 结合物 1 / 结合物 2HIV 1 Ab
9、 : 抗p24单抗 . 生物素标记的抗HIV单抗 . 亲和素标记的过氧化物酶结合物 TMB / H2SO4PHIV Ab检测:IgG, IgA, IgM固相 血清 / 血浆 稀释液/结合物2HIV 1 Ag : gp 160 重组蛋白 . gp 41 多肽 过氧化物酶结合物功能性保守多肽 . 功能性保守多肽过氧化物酶结合物HIV 2 Ag: gp36多肽. gp 36 多肽过氧化物酶结合物TMB / H2SO4PHIV Ab/Ag特点HIV-Ab与HIV-Ag双检测系统 HIV-Ag和HIV P24抗体共同包被 HRP标记HIV-Ag和HRP标记亲和素共同组成酶标试剂双抗原夹心法测HIV-Ab
10、 包被抗原+HRP标记抗原双抗体夹心LAB法测HIV-Ag 包被抗体生物素标记抗体HRP标记亲和素生物素-亲和素反应系统应用50份标本混合阳性 每10份标本再检测 阳性每一份标本再检测集合集合HIVHIV核酸检测用于血液筛查核酸检测用于血液筛查集合 HIV RNA 检测方法用于在HIV抗体阴性的血清（血浆）样本中筛查处于急性感染期HIV RNA阳性的样本。集合HIV RNA RT-PCRHIV RNA RT-PCR样本的路线集合的拆分检测路线应用集合PCR技术发现窗口期感染者MSM VCTIDU 筛查- 筛查+ 集合PCR WB +结合流行病史，判断窗口期感染MSM人群早期感染建议检测流程20
11、23-4-6男男性行为人群HIV-1早期感染检测策略及新发感染率研究婴幼儿HIV感染的诊断HIV感染产妇生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸检测进行早期HIV感染诊断。逆转录PCR（RT-PCR）方法，一般需扩增HIV gag 和pol 和env 基因片段。如果儿童第一次采血时已满12个月，则应首先进行HIV抗体检测。对于抗体阳性者进行HIV核酸检测。如果已满18个月，不做核酸检测。 婴幼儿感染诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测HIV感染产妇所生婴儿尽快采集第二份血样本，送检出生后6周采集第一份血样本（可制备成滤纸片干血斑（DBS），或EDT
12、A抗凝全血），送检继续随访报告阳性婴儿满3个月，再次采集血样本，送检尽快再次采集血样本，送检报告阴性呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应呈阳性反应呈阴性反应呈阴性反应核酸检测流程1.实验室要求 ： 实验室分级：初筛实验室 确证实验室 粤卫2004305号文规定：05年6月份前在县级以上收治定点医院建立初筛实验室。填写申请、评审、批准 要求： HIV血清学试验：BSL- (P2) HIV病毒研究： BSL- P3) 初筛实验室设计和建造的要求： 有专用实验室（至少专用检测台），应划分清洁区和污染区，并有明显标记，有充足的操作空间。(2) 实验室墙面、地面、台面材料应来耐酸、碱、易清
13、洁消毒、不渗漏液体；室内应有防蚊、防蝇、防鼠等设备 检验台上应装置紫外灯。 备有消毒药品、消毒器材和消毒设备。 有感应流水装置，备有冲眼睛水，足够的 一次性手套、口罩、隔离服和防护眼镜。(6) 实验室应装置恒温设备,室温为2025。BSL 实验室：设计和建造的要求（ 增加）： 应有专门放置生物废弃物容器的台(架)。 应设置实施各种消毒方法的设施，如高压灭 菌锅、化学消毒装置等对废弃物进行处理。 应设置洗眼装置。 实验室门宜带锁、可自动关闭。 实验室出口应有发光指示标志。BSL 实验室： 生物安全柜或其他物理抑制设备生物安全柜或其他物理抑制设备医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则(试行)(
14、2004.5.31) ：第八条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，应当立即实施以下局部处理措施：1 用肥皂液和流动水清洗污染的皮肤，用生理盐水冲洗粘膜。 2 如有伤口，应当在伤口旁轻轻挤压， 尽可能挤出损伤处的血液，再用肥 皂液和流动水进行冲洗；禁止进行 伤口的局部挤压。3 受伤部位的伤口冲洗后，应当用消毒液，如75酒精或0.5碘伏进行消毒，并包扎伤口，被暴露的粘膜，应当反复用生理盐水冲洗干净 第九条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，医疗机构应当对其暴露的级别和暴露源的病毒量水平进行评估和确定 第十条 艾滋病病毒职业暴露级别分为三级一、发生以下情形，确定为一级暴露：1 暴露源为体液、血液或者
15、含有体液、 血液的医疗器械、物品。2 暴露类型为暴露源沾污了有损伤的 皮肤或者粘膜，暴露量小且暴露时 间较短。二、发生以下情形，确定为二级暴露：1暴露源为体液、血液或者含有体液、 血液的医疗器械、物品。2 暴露类型为暴露源沾污了有损伤的 皮肤或者粘膜，暴露量大且暴露时 间较长；或者暴露类型为暴露源刺 伤或者割伤皮肤，但损伤程度较轻， 为表皮擦伤或者针刺伤。三、发生以下情形，确定为三级暴露：1暴露源为体液、血液或者含有体液、 血液的医疗器械、物品。 2 暴露类型为暴露源刺伤或者割伤皮肤， 但损伤程度较重，为深部伤口或者割 伤物有明显可见的血液。第十一条 暴露源的病毒载量水平分为： 轻度、重度和暴
16、露源不明三种类型。 暴露源不明：不能确定暴露源是否为 HIV病毒阳性者轻度：经检验，暴露源为HIV病毒阳性， 但滴度低，艾滋病病毒感染者无 临床症状、CD4计数正常者。重度：经检验，暴露源为HIV病毒阳性， 但滴度高，艾滋病病毒感染者有临 床症状、CD4计数低者。第十二条： 医疗卫生机构应当根据暴露级别和暴露源病毒载量水平对发生艾滋病病毒职业暴露的医务人员实施预防性用药方案。第十三条 预防性用药方按分为基本用药程序和强化用药程序。基本用药程序：为两种逆转录酶制剂，使用常规 剂量，连续使用28天。强化用药程序：是在基本用药程序的基础上，同 时增加一种蛋白酶抑制剂，使用 常规治疗剂量，连续使用28天。 预防性用药应当在发生艾滋病病毒职业暴露后尽早开始，最好在4h内实施，最迟不得超过24h；即使超过24h，也应当实施预防性用药。（早、有） 发生一级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度时，可以不使用预防性用药； （一级轻度不用药） 发生一级暴露且暴露源的病毒载量水平为重度或者发生二级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度时，使用基本用药程序。 （一级重度或二级轻度用基本） 发生二级暴露且暴露源的病毒载量
