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1、内切葡聚糖酶基因在巨大芽抱杆菌中重组表达载体的构建四川生物科学2003级廖俊华指导教师陈惠教授摘要：以生物化学与分子生物学实验室克隆并测序的枯草芽花杆菌C-36内切葡聚糖酶基因(Genbank登录号：DQ782954)为模板，通过PCR将编码信号肽的序列去除，然后与PMDI8TVeCtOr克隆载体连接，构建PMDI8-TVector亚克隆载体。对PMDI8-TVector质粒先进行a711单酶切，回收后再进行&7I单酶切，通过两次单酶切胶回收内切葡聚糖酶基因(不含信号肽)，并构建巨大芽花杆菌重组表达载体PHEC-End,将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5中。通过对转化子进行菌落PCR与质粒的酶
2、切检测证明成功构建了内切葡聚糖酶的巨大芽袍杆菌表达载体。关键词：巨大芽抱杆菌，枯草芽抱杆菌，内切葡聚糖酶,重组表达载体ConstructionofeukaryoticExpressionVectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumLIAOJun-huaBiologicalScience,Grade2(X)3DirectedbyChenHui(Prof)Abstract:BythewayofPCR,thesequencecomingfromendoglucanasegene(GenbankNo.DQ782954)inB.subtilisC-
3、36strainandcodingforthesignalpeptideofendoglucanasewasremoved.TheendoglucanasegenewasclonedandsequencedintheLaboratoryofBiochemistryandMolecularBiology.ThenthegenewithoutthesignalpeptidesequencewasligatedwiththecloneplasmidpMD18-T.ThepMD18-TVectorwasconstructed.First,thepasmidwascutedbyBgl.Then,thep
4、asmidwascutedbySphI.Bydoubleenzyme-cut,thegeneofendoglucanaseinB.subtilisC-36strainwithoutsignalpeptidewasrecived.TheeukaryoticexpressionvectorpHEC-Endwasconstructed.Eventually,theeukaryoticexpressionvectorwastransformedintocompetentE.coliDH5.BythewayofcolonyPCRandrestrictionenzymedigestinganalysis,
5、theeukaryoticexpressionvectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumwasconstructedsuccesfully.Keywords:BacillusMegaterium,Bacillussubtilis,endoglucanase,eukaryoticexpressionvector纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不一致能够分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶与B-葡萄糖甘酶三大类。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，关于人类社会解决食物短缺与能
6、源危机具有重大的现实意义。随着中性纤维素酶与碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能与巨大的经济价值。纤维素酶成本高与酶活力低已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此，构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。几乎所有已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到了表达，但是都几乎存在着表达量低、分离提纯困难的缺陷。而芽泡杆菌因具有特殊的蛋白分泌系统，使得在表达外源蛋白的宿主菌中深受青睐。其中枯草芽胞杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，同时已用于商业化生产酶制剂，比如，Genecor厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工
7、程菌。近年来，巨大芽狗杆菌也在这方面显示出了较好的应用前景，与枯草芽狗杆菌相比，巨大芽泡杆菌还具有两大优点：首先是它不具有碱性蛋白酶，从而使外源蛋白能很好的表达而不被降解；再次是重组质粒能够在宿主菌中稳固存在。有很多蛋白已经成功地在巨大芽狗杆菌中得到过量表达，如：RygUS与HiIICn(1991)在巨大芽抱杆菌中成功地表达了四种外源蛋白基因，在木糖操作子的调控下，这些基因的表达提高130到350倍不等,且未发现蛋白酶水解情况。目前还未见有关在巨大芽袍杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道，四川农业大学生物化学实验室通过自行筛选得到一株产内切葡聚糖酶的枯草芽泡杆菌并克隆到了编码该酶的基因(Genbank
8、No.DQ782954),拟在此基础上构建该基因的巨大芽泡杆菌表达载体，实现该基因在巨大芽胞杆菌中的分泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽胞杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽胞杆菌表达载体PHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研窕枯草芽范杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽狗杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1材料与方法1.1 菌株及载体：本工作所使用的菌株与质粒见表Io表1实验所用的菌株及质粒Tab1ThestrainandplasmidusedintheexperimentSlrainZplasmidCharacter
9、isticssourceJM109recA1supE44endA1hsdR17gyrA96relAlthi(lac-proAB)FStoredinthislabDH5supE44lacU169(801acZM15)recAlStoredinthislabpMD18-TVectorAmprIacZTaKaRaBiotechnologypHIS1525TetrAmprxylRPxylAMoBiTecB3plasmidpMD18-TVectorincludingtheendoglucanasegeneConstructedinthislab1.2 分子生物学试剂:引物由上海英俊生物技术有限公司合成；
10、BglVl、SphIy重组TaqDNAPolymerasedNTPT4DNALigasepMD18-TVeCtor购自TaKaRaBiotechnology；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNAMarkerIIKDNAMarkerVIKDNAHindIn购自天为时代;氨茉青霉素购自上海生工。1. 3要紧药品NaCk胰蛋白陈、酵母浸出粉、琼脂粉、琼脂糖、0.lmolLCaCl2、甘油（终浓度为30%）o1.4 要紧仪器：电热恒温培养箱、HZQ-F全温振荡培养箱、酸碱PH计、TGLT6G台式普通离心机、板式电泳槽、电热恒温水浴锅、PCR仪、凝胶成像仪等。1.5 培养基、抗生素贮存液及琼脂糖电泳缓
11、冲液：LB培养基：1%胰蛋白陈，1%NaCb0.5%酵母浸出粉，pH7.0（用lmolL的NaOH调PH值）；配制固体培养基时需加入1.5%-2.0%的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入氨苇青霉素（终浓度为IOoUgmL）。氨茉青霉素（AnIP）贮存液：100口8/疝（溶于双蒸水中），过滤除菌，小份分装（ImL/份）后，-20C储存。琼脂糖电泳缓冲液叫5XTBE贮存液:54gTris碱，27.5g硼酸,20mL0.5molLEDTA(pH8.0),溶于IL去离子水，用时稀释10倍。0.5molLEDTA(pH8.0)：将186.Ig二水乙二胺四乙酸(EDTA-Na.2乩0)加入80OmL水中，用
12、磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节PH至8.0,定容至IL0.7%的琼脂糖凝胶：称取0.7g琼脂糖于IoomLO.5XTBE中，用微波炉加热置溶液澄清为止，然后加入5HL的GOldVieW核酸染料，混匀即可用。1.6方法.1.6.1引物的设计：根据已经克隆并测序的内切葡聚糖酶基因(Genbank登录号：DQ782954),结合信号肽预测结果，应用PrimerPremier5.0软件设计一对引物，使其通过PCR去掉该基因自身信号肽编码序列，同时加入适当的酶切位点(BgIU、SPh1),使其能够通过连接将该基因置于表达载体信号肽编码序列之后(表达载体PHlSl525的多克隆位点序列如图1),且保证
13、正确的阅读框。已经预测的枯草芽狗杆菌C-36内切葡聚糖酶蛋白序列信号肽切割位点在29位与30位氨基酸残基之间，成熟蛋白为470氨基酸多肽，因此设计引物如下：上游引物(Pi)：5,Agatctcagcagagacaaaaacgccagt3下游引物(P2)：5,Gcatgcctaatttggttctgttccccaa3下划线是引入的酶切位点，分别是知II、Sph,A是为了不改变阅读框而引入的碱基。STARTMs%BsrGIArcTACAffiAAAAA(JTMTrAT(；GCATTCvnvnTGEATCG(TGATT(工Vr(KnTn(JCaxTC(KCT(1(XXX;CANarItSfoISma
14、I.KpnI,KaSLBbClBSDElXmalAcc65ISDhlCC(A门GAAGAInCCGGA(JClCCCCKiCiAICC,IACCCiCKX(；(AH；(CGGCCTnAGAGGAroGCArCACCAIrACCArCBglEcoICRI,BamHIEagINgOMiy6xHisBanlLSacINaeIMCSAeeIAmAeCGGTCCAAGAArStop图1pHIS1525的多克隆位点序列FiglSequenceofthemultiplecloningsites(MCS)ofpHIS15251. 6.2目的基因的获得：1.6. 2.1B3质粒的提取及其PCR接种一环B3菌株于
15、IomLLB液体培养基中，37C200rmin培养过夜，用质粒提取试剂盒按操作说明提取B3质粒。以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCRU。，通过PCR获得目的基因，其反应体系如表2：表2PCR反应体系Table2CompositionofPCR试剂名称用量ddH2O32.5L10PCRbuffer5.oL25mmolLMgCl22.0LPl1.0LP21.0LdNTPmixture6.OL模板DNA2.OLTaq聚合酶0.5LTotalvolume50.OUL按上述顺序加入各组分后混合均匀，PCR反应参数为：94预变性2min,94C变性Imin,65退火Imin,72C延伸90s,30个循环后，72再延伸IOmin,4C储存。反应结束后取3MPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6.2. 2PCR产物的纯化由于克隆需要的DNA片段需要较高的纯度，PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳充分分离后，利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从凝胶中回收目的DNA片段UL1. 6.3目的基因的克隆：1.6. 3.1大肠杆菌JMIo9（或者DH5a）感受态细胞的制备：参照分子克隆试验指南（第三版），使用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，具体方法如下：
