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1、水体中微囊藻基因的测定实时荧光定量PCR法（征求意见稿）编制说明二零二三年一月1项目背景错误!未定义书签。2项目来源错误!未定义书签。3标准制定工作概况错误!未定义书签。3.1 标准制定相关单位及人员错误!未定义书签。3.2 主要工作过程错误!未定义书签。4标准编制原则、主要内容及确定依据错误!未定义书签。4.1编制原则错误!未定义书签。4.2主要内容及确定依据错误!未定义书签。5标准先进性体现错误!未定义书签。6与现行相关法律、法规、规章及相关标准的协调性错误!未定义书签。6.1目前国内执行的标准和文件错误!未定义书签。6.2本标准与相关法律、法规、规章、强制性标准相冲突情况错误!未定义书签
2、。7社会效益错误!未定义书签。8重大分歧意见的处理经过和依据错误!未定义书签。9废止现行相关标准的建议错误!未定义书签。10提出标准强制实施或推荐实施的建议和理由错误!未定义书签。11贯彻标准的要求和措施建议错误!未定义书签。12其他应予说明的事项错误!未定义书签。附录1错误!未定义书签。附录2错误!未定义书签。附录3错误!未定义书签。水体中微囊藻基因的测定实时荧光定量PCR法编制说明1项目背景近年，水体富营养化已成为一个全球关注的环境问题，在富营养化水体中存在高浓度的营养性物质，如氮、磷等，可促使藻类大量生长形成水华。早在19世纪末，就有动物饮用含有蓝藻污染物的水而出现死亡的相关报道。因此，
3、湖泊富营养化和蓝藻水华是同前全世界共同面临的重大环境问题之一。在水华期间，会使湖泊生物多样性下降，而且产毒蓝藻会释放大量生物毒素，其中蓝藻产生的次级代谢产物一微囊藻毒素(MieroCyStin,MC)危害程度较强，它是一种在蓝藻水华污染中产生量最大、出现频率最高和造成危害最严重的藻毒素种类之一。这些毒素可在鱼、虾、蟹等水生动物富集，经食物链可影响人类健康，既能影响渔业养殖，也可造成饮用水安全等问题。产生微囊藻毒素的藻类主要有蓝藻门微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属，蓝藻毒素通过其危害方式可分为肝毒素和神经毒素，它们是肝癌的强烈促癌剂，另一类毒素对皮肤有刺激作用。当蓝藻细胞破裂或死亡时，毒素就会被释放到
4、水中，常规的水处理工艺不能有效的将它去除。许多水体爆发的“水华”是由蓝藻的疯狂生长引起的，而在水华蓝藻中又以微囊藻为优势种，常见的微囊藻中既有产毒株也有不产毒株，常规的蓝藻监测以显微镜下形态观察、计数为主，方法粗略，易漏检或误检。并且产毒株和不产毒株在显微镜下的形态是一样的，肉眼无法分辨，因此常规显微镜镜检法准确度不高，有待于发展既快又准确的产毒微囊藻的检测方法。2项目来源由嘉兴同济环境研究院2022年1月向浙江省质量合格评定协会提出立项申请，经省质量合格评定协会论证通过。2022浙江省质量合格评定协会团体会员转入浙江省质量协会，标准由浙江省质量协会标准化委员会归口。3标准制定工作概况3.1
5、标准制定相关单位及人员3.1.1 本标准牵头组织制定单位：浙江省质量协会。3.1.2 1.2本标准主要起草单位：嘉兴同济环境研究院。3.1.3 本标准参与起草单位：川源（中国）机械有限公司、南京山普罗特有限公司3.1.4 本标准实验比对单位：嘉兴同济环境研究院、宁波职业技术学院、宁波海关技术中心、南京山普罗特有限公司、云南方源科技有限公司3. 1.5本标准起草人为：*3.2主要工作过程3.2.1前期准备工作。（1）2020年6月至今，嘉兴同济环境研究院同川源（中国）机械有限公司合作开展藻类快速检测技术的开发研究。（2）2020年至2022年完成嘉兴市市本级水源地藻毒素的采样与检测12批次，完善
6、检测方法。标准立项组建了标准工作组，确了负责人和各编写人员和分工职责，如表3-1所示。表3-1人员情况序号姓名工作单位职称分工1史少礼浙江省质量协会主任会议组织2程坡浙江省质量协会职员会议组织3郭俊明宁波大学主任/教授立项评审专家组长4吴国祥嘉兴市方圆检测技术有限公司正高立项评审专家5连加储中国计量大学副教授立项评审专家6夏志勇浙江舜虞达环境科技集团有限公司高级工程师立项评审专家7吕升浙江省嘉兴生态环境监测中心正高工立项评审专家8周仰原嘉兴同济环境研究院常务副院长标准总负责9孟祥周嘉兴同济环境研究院副院长/教授标准技术负责10靳立民嘉兴同济环境研究院主任/高工标准编写11王乾川源（中国）机械有
7、限公司总经理标准技术对接12张秋晓川源（中国）机械有限公司职员实验13章夏芸川源（中国）机械有限公司职员实验14郑博之川源（中国）机械有限公司圭事长特别助理标准技术落实15章跃龙宁波海关技术中心职员实验数据比对16章胜乔宁波海关技术中心职员实验数据比对17张钧场南京山普罗特有限公司博士实验数据比对18鲁同宁波职业技术学院副研究员实骁数据比对19黄伟初昆明金泽实业有限公司正高级工程师实验数据比对20余秋宏云南方源科技有限公司总经理助理/工程师实验数据比对21雷锋良云南方源科技有限公司主任/工程师实验数据比对3.2.2标准草案研制3.2.2.1必要性微囊藻毒素的检测分析方法主要有生物分析法（如小鼠
8、腹腔注射）、物理化学分析法（如高效液相色谱法HPLO和生物化学分析法（如酶联免疫检测技术ELISA,蛋白磷酸酶抑制分析PPIA等）。上述方法均不能在毒素从藻细胞内释放出来之前对水体中微囊藻的产毒能力进行判断，因此无法对潜在的产毒微囊藻进行预检以预防产毒微囊藻对人体健康及环境的危害。3.2.2.2可行性使用实时荧光定量PCR法可以在水华爆发之前对水体中产毒微囊藻进行检测，为水体富营养化的预防预警提供了可靠的数据和方法，而且其操作更简单、快速，有效监测预警水体安全和健康。方法检测不会对环境造成二次污染，与传统的检测产毒微囊藻的方法相比具有明显的优势。但由于没有关于微囊藻与产毒微囊藻qPCR测定方法
9、的国家标准/行业标准，使微囊藻与产毒微囊藻qPCR的测试没有统一、规范的方法，本标准的制定可以规范、统一产毒微囊藻qPCR的试验方法，为水体环境的安全和健康发展提供支撑。3.2.2.3编制草案情况本标准编制基于前期的工作内容与数据，在实验中固定了分析方法，形成了内部的规范操作。再经过1年的实践验证方法的稳定性和可行性，形成编制草案。实验室比对找到了4家实验室宁波职业技术学院、宁波海关技术中心、南京山普罗特有限公司、云南方源科技有限公司，嘉兴同济环境研究院有2台qPCR设备,分别由不同人员进行操作，做为2个数据比对实验室，符合环境监测分析方法标准制订技术导则(HJ168-2020)中的要求。3.
10、 2.3征求意见2023年*月*日标准开始在面向公众发布征求意见稿，。4. 2.4专家评审2022年12月7日，省质量协会组织专家召开了水体中微囊藻基因测定实时荧光定量PCR法团体标准启动评审会，评审委员会由浙江省质量协会、嘉兴市方圆检测技术有限公司、浙江省嘉兴生态环境监测中心、浙江舜虞达环境科技集团有限公司、中国计量大学、宁波大学的7名专家组成。评审委员会审查了送审材料和标准的全部内容，并形成了评审意见。5. 2.5标准报批202*年*月*日，标准形成送审稿提交省质量协会。4标准编制原则、主要内容及确定依据6. 1编制原则(1)科学性原则。规范应在统一的技术标准下制定，并按照公开、公正、科学
11、的评判原则开展充分论证和同行评估。(2)先进性原则。规范应充分借鉴国内外已有技术标准和最新政策文件，确保技术先进、原理正确、内容可靠。(3)实用性原则。规范应充分考虑我国现阶段环境管理需求并与之相适应，具有较好的可操作性。4.2主要内容及确定依据4.2.1技术框架本文件按环境监测分析方法标准制订技术导则(HJ168-2020)中的要求和参照转基因植物及其产品成分检测实时荧光定量PCR方法制定指南(农业部2259号公告-5-2015)中的要求编写。4.2.2内容结构本文件共9章。第1章为适用范围，第2章为规范性引用文件，第3章为术语和定义，第4章为方法原理，第5章为试剂和材料，第6章为仪器与设备
12、，第7章为样品，第8章为分析步骤，第9章为质量保证与控制。4.2.3适用范围的内容及论据本文件规定了实时荧光定量PCR法测定水体中总微囊藻基因和产毒微囊藻基因的条件与详细步骤。本文件适用于饮用水、地表水中总微囊藻基因和产毒微囊藻基因的测定。4.2.4规范性引用文件的内容及论据本文件的规范性引用文件包括：GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ494水质采样技术指导本文件涉及的规范性引用文件主要用于水样的采集。4.2.5术语和定义的内容及论据Ct值CyClethreshold每个管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4.2.6方法原理实时荧光定
13、量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本方法运用TaqMan探针法，利用荧光共振能量转移现象，使系统中的荧光强度或者荧光种类发生变化，通过检测这种变化可测出PCR反应体系中产物的种类和量。4.2.7试剂和材料样品分析过程所需的试剂和材料，并按qPCR方法的要求，加入了引物和探针的序列。4.2.8仪器与设备在测定过程中所需的仪器和设备，并提出参数上的要求。4.2.9样品(1)水样的采集都有相关的采样标准和规范- 点位布设、采样频次及采样方法按照GB/T1
14、4581、HJ/T91和HJ494的相关规定执行。- 使用采样瓶时用水样充分润洗3次，再采集水样。- 使用采水器采集IL样品至采样瓶中。若水体透明度较高，浮游植物数量较少时，应酌情增加采样体积。样品采集时采样瓶不应装满，以便摇匀。(2)水样的运送和保存运输过程应在保温箱中保持水样温度应在24h内完成过滤，过滤后的样品在-20。C冰箱中保存待检。4.2,10分析步骤(1)准备样品提取前的材料准备工作。(2)过滤按操作要求过滤水样。3) )DNA提取不同厂家的提取试剂盒的操作要求可能会不一样，需按厂家要求的步.骤提取，提取成功后置于-20。C保存备用。4) 2.11测定测定步骤分为标准曲线的配制、
15、反应体系配制、加样、计算等。(1)标准曲线配制标准品源液要放在-20。C冰箱中保存，一般浓度为10copiesM-1012copiesL,室温融解。同一标准品源液反复冻融不要超过3次，否则易产生改性。移取适量标准品原液至0.5mL离心管,用无菌水稀释至IXlo*copiesL,将稀释过标准品在震荡器上震荡约10秒，使用迷你离心机离心约5秒。以10倍重复稀释步骤，逐级稀释制作7个标准品，其系列浓度分别为：1X1()7COPieS/m八1IOfiCoPieS/m八110sCoPieS/ML、1IO1COPieS/PL、1IO3COPieS/NL、1IO2CoPieS/NL、1IO1copiesLo(2)反应
