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1、化验员培训化验员培训 食品微生物检验食品微生物检验微生物：微生物：一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一些个体微小（一般些个体微小（一般0.1mm）、构造简单的低等生物（单细胞或结构、构造简单的低等生物（单细胞或结构较为简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的生物）。较为简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的生物）。微生物的五大共性：微生物的五大共性：1.体积小、面积大体积小、面积大 2.吸收多吸收多 、转化快、转化快 3.生长旺、繁殖快生长旺、繁殖快 4.适应强、易变异适应强、易变异5.分布广、种类多。分布广、种类多。微生物的分布：微生
2、物的分布：1.土壤土壤 2.水水 3.空气空气GB/T 20977-2007 糕点通则：本标准适用于中式糕点产品的生产、检验和糕点通则：本标准适用于中式糕点产品的生产、检验和销售，本标准不适用于裱花蛋糕和月饼。销售，本标准不适用于裱花蛋糕和月饼。GB/T 20977-2007 糕点通则（冷加工糕点）糕点通则（冷加工糕点）项目项目指标指标大肠菌群（大肠菌群（MPN/100g）300菌落总数（菌落总数（cfu/g）10000霉菌（霉菌（cfu/g）150GB 17401-2014 食品食品国家标准膨化食品：本标准适用于预包装膨化食品。国家标准膨化食品：本标准适用于预包装膨化食品。GB 17401-
3、2014 (GB 17401-2014 (微生物限量）微生物限量）项目项目采样方案采样方案a a及限量（若非指定，及限量（若非指定，均以均以cfucfu/g/g表示）表示）检验方法检验方法n nc cm mM M菌落总数菌落总数5 52 210104 410105 5GB4789.2GB4789.2大肠菌群大肠菌群5 52 21010100100GB4789.3-2010GB4789.3-2010平板计数法平板计数法a a样品的采集及处理按样品的采集及处理按GB4789.1GB4789.1执行。执行。GB 19300-2014 食品安全国家标准食品安全国家标准 坚果与籽类食品：本标准适用于生干
4、坚果与籽类食品：本标准适用于生干和熟制的坚果与籽类食品。和熟制的坚果与籽类食品。GB 19300-2014 (GB 19300-2014 (微生物限量）微生物限量）项目项目采样方案采样方案a a及限量（若非指定，均以及限量（若非指定，均以cfu/gcfu/g表示）表示）检验方法检验方法n nc cm mM M大肠菌群大肠菌群5 52 2101010102 2GB4789.3-2010GB4789.3-2010平板平板计数法计数法霉菌霉菌b b2525GB4789.15GB4789.15 a a样品的采集及处理按样品的采集及处理按GB4789.1GB4789.1执行执行 b b仅适用于烘炒工艺加
5、工的熟制坚果与籽类食品。仅适用于烘炒工艺加工的熟制坚果与籽类食品。 生产车间现场涂抹实验菌落总数检验依据生产车间现场涂抹实验菌落总数检验依据GB/T 18204.32013中华人民中华人民 共和国共和国 国家标准国家标准 公共场所卫生检验方法第公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物部分：空气微生物 中中3.3自自 然沉降法。将营养琼脂平板暴露在空气中，微生物根据重力作用自然沉然沉降法。将营养琼脂平板暴露在空气中，微生物根据重力作用自然沉 降降 到平板上，经实验室培养后得到菌落数的测定方法。到平板上，经实验室培养后得到菌落数的测定方法。 大肠菌群检验依据大肠菌群检验依据GB14934-94食（
6、饮）具消毒卫生标准，用食（饮）具食（饮）具消毒卫生标准，用食（饮）具 快速检测纸片进行取样、培养观察。将接种好的纸片放入快速检测纸片进行取样、培养观察。将接种好的纸片放入37培养培养16 18h。纸片呈均匀紫蓝色为阴性；纸片变黄，在黄色背景上出现红色斑。纸片呈均匀紫蓝色为阴性；纸片变黄，在黄色背景上出现红色斑 点或片状红晕为阳性。点或片状红晕为阳性。检验项目检验项目 依据依据方法代号及名称方法代号及名称菌落总数菌落总数GB 4789.2-2010 食品食品安全国家标准安全国家标准 食品微生物学检验食品微生物学检验 菌落总数菌落总数测定；测定；GB/T 18204.3-2013 中华人民共和国国
7、家标准中华人民共和国国家标准 公共场所卫生检验方法第公共场所卫生检验方法第3 部分：空气微生物部分：空气微生物 大肠菌群大肠菌群GB/T 4789.3-2003 食品食品卫生微生物学检验卫生微生物学检验 大肠菌群测定；大肠菌群测定；GB 4789.3-2010 食品安全食品安全国家标准国家标准 食品微生物学检验食品微生物学检验 大肠菌群大肠菌群计数；计数；GB14934-94 食食（饮）具消毒卫生标准（饮）具消毒卫生标准霉菌霉菌 酵母菌酵母菌GB 4789.15-2010 食品食品卫生微生物学检验卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数霉菌和酵母计数出厂成出厂成品品 OEM半成品及半成品及成品成品 生
8、产生产车间现场车间现场涂抹、食堂餐具及菜涂抹、食堂餐具及菜 原辅料、包辅材料原辅料、包辅材料 研发实验策划保质期产品研发实验策划保质期产品恒温培养箱恒温培养箱：361 ，281 。冰箱：冰箱：25 天平：感量为天平：感量为 0.1 g。净化操作台净化操作台恒温水浴箱恒温水浴箱：46 1无菌锥形瓶无菌锥形瓶：容量：容量 250 mL、500 mL。放大镜或放大镜或/和菌落计数器和菌落计数器/显微镜显微镜无菌培养皿无菌培养皿：直径：直径 90 mm高压灭菌锅高压灭菌锅蒸馏水器蒸馏水器酒精灯酒精灯、灭菌试管、灭菌镊子、灭菌剪子、灭菌试管、灭菌镊子、灭菌剪子等等。无菌吸管：无菌吸管：1 mL（具（具
9、0.01 mL 刻度刻度）、）、10 mL（具（具 0.1 mL 刻度）或微量移液刻度）或微量移液 器及吸头器及吸头检测项目检测项目检验方法检验方法所需药品所需药品名称名称适用产品清单适用产品清单大肠菌群大肠菌群GB /T4789.3-2003 乳糖胆盐乳糖胆盐发酵培养基发酵培养基BR原辅料、末梢水、早餐派、原辅料、末梢水、早餐派、蔓越莓干成品、蔓越莓干成品、研发实验研发实验策划保质期产品策划保质期产品伊红伊红美蓝美蓝琼脂（琼脂（EMB）BR革兰氏染色革兰氏染色液液BR大肠菌群大肠菌群GB 4789.3-2010第一第一法法MPN计数法计数法月桂基硫酸盐胰蛋白胨月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤肉汤BR
10、辅料蜂蜜辅料蜂蜜煌绿乳糖煌绿乳糖发酵培养基发酵培养基BR大肠菌群大肠菌群GB 4789.3-2010第二第二法法平板平板计数法计数法结晶紫中性红胆盐结晶紫中性红胆盐琼脂琼脂BR所有成品、所有成品、OEM半成品及半成品及成品、成品、蔓越莓干半成品蔓越莓干半成品煌绿乳糖煌绿乳糖发酵培养基发酵培养基BR菌落总数菌落总数GB 4789.2-2010平板计数琼脂（平板计数琼脂（PCA）BR公司生产原辅料、半成品公司生产原辅料、半成品及成品及成品霉菌、酵霉菌、酵母菌母菌GB 4789.15-2010孟加拉红孟加拉红培养基培养基BR公司坚果、籽类半成品及公司坚果、籽类半成品及成品成品备注备注:氯化钠氯化钠A
11、R药品用于配制药品用于配制0.85%生理盐水生理盐水。1 实验开始前的准备实验开始前的准备1.1实验前要按照相应培养基的配方配制培养基并在高压蒸汽灭菌锅内实验前要按照相应培养基的配方配制培养基并在高压蒸汽灭菌锅内121 灭菌灭菌15min。 （结晶紫中性红胆盐琼脂培养基除外）（结晶紫中性红胆盐琼脂培养基除外）1.2 将实验所要用到的生理盐水、将实验所要用到的生理盐水、培养皿培养皿、移液管（移液枪头）准备好并灭菌。、移液管（移液枪头）准备好并灭菌。1.3 将无菌间、超净工作台的紫外灯打开杀菌将无菌间、超净工作台的紫外灯打开杀菌3040min。2样品前处理样品前处理 在酒精灯火焰旁，用被火焰灼烧灭
12、菌后的剪刀剪开样品包装袋，称取在酒精灯火焰旁，用被火焰灼烧灭菌后的剪刀剪开样品包装袋，称取25g样品置盛有样品置盛有225ml生理盐水的无菌杯内，轻轻震摇，制成生理盐水的无菌杯内，轻轻震摇，制成 1:10 的样品匀液。的样品匀液。注：注：1.结晶紫中性红胆盐琼脂培养基要现配现用，煮沸不得超过结晶紫中性红胆盐琼脂培养基要现配现用，煮沸不得超过2min,要在要在3h内内 使用完。使用完。 2.制备的样品匀液要在制备的样品匀液要在15min内完成接种内完成接种 检样检样25g(ml)样品样品+225ml+225ml稀释液，均质稀释液，均质1010倍系列稀释倍系列稀释选择选择2 2个个33个适宜稀释度
13、的样品匀液个适宜稀释度的样品匀液，各各取取1ml1ml分别加入无菌培养皿内分别加入无菌培养皿内每皿中加入每皿中加入10ml20ml10ml20ml平板计数琼脂培养基，混匀平板计数琼脂培养基，混匀 培养培养(36(361,481,482h)2h) 计数各平板菌落数计数各平板菌落数 报告报告菌落总数检验程序图菌落总数检验程序图 3 样品样品的稀释的稀释 3.1 用用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注，沿管壁缓慢注于于 盛盛 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖
14、端不要触及稀释液面），）， 振振摇试管或摇试管或换换1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 样品匀样品匀 液液。 3.2 按按 3.1操作程序，制备操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释倍系列稀释样品匀液。每递增稀释 一次，换用一次，换用1 次次1 mL 无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。4 根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择 2 个个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体个适宜稀释度的样品匀液（液体 样品可包括原液），在进行样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释时，倍递增稀释时， 吸取吸取 1 mL 样品匀
15、液于无菌平样品匀液于无菌平 皿内，每个稀释度做两个平皿。（目前，化验中心成品样使用皿内，每个稀释度做两个平皿。（目前，化验中心成品样使用10-1和和10-2两两 个稀个稀 释度，食堂菜样使用释度，食堂菜样使用10-2和和10-3两个稀两个稀 释度）同时，分别吸取释度）同时，分别吸取 1 mL 空白空白 稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。 5及时将及时将 15 mL20 mL 冷却至冷却至 46 的平板计数琼脂培养基（可放置于的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合 均
16、匀。均匀。 6 待琼脂凝固后，将平板翻转，待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养培养48 h2 h。7菌落计数菌落计数 ：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相 应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。）表示。 7.1 选取菌落数在选取菌落数在 30 CFU300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。 低于低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU的可记录为多不可计。每个的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 7.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生 长的长的 平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落 分布又很均匀
