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1、2022肿瘤细胞外囊泡代谢组学研究进展(全文)摘要细胞外囊泡(EV)能够携带包括核酸、蛋白和小分子代谢物在内的多种生物活性成分，其在肿瘤诊断与治疗中的价值已得到广泛认可。然而目前对于EV内含物的研究主要集中在RNA和蛋白质上,对于最能直接反映细胞状态的小分子代谢物在EV中的作用尚不明确。近年来EV代谢组学在肿瘤研究中逐渐受到了关注，尽管由于前处理复杂且代谢物含量较低，EV代谢组学研究仍存在诸多挑战，但其在调控肿瘤进展及作为肿瘤标志物方面的价值已逐步显现，有望为肿瘤的诊断与治疗提供新的靶点。细胞外囊泡(extrace1.1.u1.arvesic1.es,EV)是一种具有双层磷脂膜结构的囊泡小体，
2、EV从其大小及分离方式上可以分为小细胞外囊泡(sma1.1.extrace1.1.u1.arvesic1.es,sEV)和大细胞外囊泡(1.argeextrace1.1.u1.arVeSideS,IEV),而从其产生方式上又可以分为外泌体、微囊泡、凋亡小体等11.EV能够特异地将来源细胞的蛋白质、核酸和代谢物等物质包裹在内，它们作为EV携带的货物，一方面能够作为标志物反映来源细胞的状态，另一方面也能够在细胞间传递信息，诱导靶细胞的生命活动发生改变20此外本团队的前期研究也证实EV在肿瘤的远处转移中也发挥着重要作用30细胞代谢的改变是肿瘤的重要特征，肿瘤细胞可以通过这些改变来满足自身快速生长的需
3、求。小分子代谢物是与细胞表型和状态最直接相关的分子,随着研究的深入，人们越来越认识到了代谢组学在肿瘤中的重要价值40然而目前肿瘤EV的相关报道大都集中于RNA和蛋白，EV代谢组学研究还相对欠缺。一、肿瘤来源EV的代谢组学特征首先，与来源细胞相比，EV含有更多的脂质（每毫克蛋白所含脂质约为细胞的8.4倍）5,且普遍存在胆固醇、鞘糖脂、鞘磷脂等脂质的富集6z这一点在前列腺癌5,71结直肠癌8和乳腺癌9细胞来源的EV中都得到了证实。此外EV还会特异性富集一些脂质，例如有研究发现，溶血磷脂酰胆碱会在前列腺癌1.nCap细胞来源的EV中富集，但其在1.nCaP细胞中的丰度却很低。此外不同EV亚类携带的代
4、谢物组成也是不同的,有研究者认为糖脂和游离脂肪酸的富集是SEV的特征，而神经酰胺和鞘磷脂的富集则是IEV的特征10,另外Yang等11的研究也发现尿液来源的SEV与IEV的脂质组成存在差异性，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等在SEV中比IEV中更丰富，造成上述差异的原因可能是不同EV亚类的发生方式不同。与正常细胞来源的EV相比，肿瘤细胞来源EV携带的代谢物也存在着差异，其中研究最多的是脂质。溶血磷脂能够通过多种不同的机制参与肿瘤进展12z13o目前有研究证明卵巢癌SKOV-3细胞来源的EV存在溶血磷脂酰胆碱的富集141.且高浓度的EV溶血磷脂酰胆碱还与乳腺癌较短的总生存期相关15o但
5、也有研究发现一些溶血磷脂如溶血磷脂酰乙醇胺在肾细胞癌患者尿液来源的EV中丰度更低160另有研究发现神经酰胺和鞘磷脂也会在某些来自肿瘤细胞的EV中富集10,且这一现象在黑色素瘤和肺癌细胞来源的EV中也得到了证实17,181.此外,胆固醇酯、酵母固醇和27-羟基胆固醇等脂质的富集也曾在肿瘤来源的EV中被报道14z19o相对而言，肿瘤来源EV携带的其他小分子代谢物的研究还相对较少。有研究发现与非肿瘤细胞相比，来自肿瘤细胞系的EV含有更多的氨基酸及其衍生物，其中脯氨酸和琥珀酸上调最为显著，另外该研究还发现在前列腺癌细胞和T细胞淋巴瘤细胞来源的EV中能够检测到更多的叶酸和肌酊20o此外还有研究发现来自头
6、颈鳞癌细胞系UMSCC47培养上清液的EV富含腺苗等瞟吟代谢产物21,这一现象在胰腺癌中也有报道22JO这些肿瘤EV携带代谢物的特异性改变（图1）为其作为肿瘤诊断标志物奠定了基础。不同肿瘤细胞来源EV的代谢物组成也发生着变化。例如，肝癌细胞系HUh7和间充质干细胞MSC来源的EV存在心磷脂的特异性富集,而脑胶质瘤细胞系U87来源的EV则被发现存在鞘磷脂的富集10o另外一项乳腺癌相关的研究也表明，与低转移性细胞相比，高转移性乳腺癌EV中不饱和二酰基甘油存在富集，脂质被选择性地装载到乳腺癌EV中9o此外，不同耐药表型231不同肿瘤亚型24f25以及不同分化程度26肿瘤细胞来源EV所携带的代谢物也存
7、在差异,这提示EV携带的代谢物还可能在肿瘤鉴别诊断中发挥作用，且特异性的EV携带的代谢物也许能够用于判断EV的来源。以上研究主要探索了细胞培养液中肿瘤来源EV的代谢组学特征，值得注意的是，虽然细胞培养液来源EV相对临床样本来源EV应有更好的一致性，但是有研究发现同种细胞不同氧浓度221不同pH17、不同培养系统6等条件也会引起EV代谢组学的变化，可见EV代谢组学是一个非常灵敏的指标，所以在比较不同细胞系EV携带的代谢物的过程中，也需要考虑不同培养条件对其产生的影响。综上，肿瘤来源EV的代谢组学表现出独有的特征，且能非常灵敏地反映细胞状态，有可能在肿瘤诊疗中发挥一定作用。二、EV携带的代谢物作为
8、肿瘤诊断标志物的价值（一）采用EV样本进行代谢组学标志物研究的优缺点与细胞培养液相比，血液及尿液等临床样本具有更大的异质性，但要想评价代谢物作为诊断标志物的价值，使用临床样本开展研究是非常必要的。体液样本和体液来源EV样本所富集的代谢物存在差异性27,目前代谢组学诊断标志物研究大多是直接采用体液样本进行分析，分离EV后再进行代谢组学研究的还相对较少。这2种研究方案各自有其优缺点。从临床应用的难易程度上讲，直接采用体液样本更加快速便捷，而提取EV进行分析，增加了前处理过程，提高了成本，因此临床应用难度较大。从诊断效能的优劣上来看，由于体液代谢物含量受饮食及化合物稳定性等多种因素的影响28,所以有
9、囊泡膜保护的EV携带的代谢物可能是标志物研究的更好选择。EV是活细胞主动分泌的，其代谢物成分具有选择性，可能包含更丰富和特异的信息。此外，EV表面的许多特异性蛋白还能够用于分离肿瘤特异性的EV290因此EV样本可能会提供更为同质化的代谢物来源，有利于富集肿瘤细胞的异常代谢改变，进而发现更加敏感和特异的代谢标志物。目前已有一些研究团队对体液代谢组学和体液来源EV代谢组学的诊断效能进行了比较18,27,30,例如Puhka等30发现，与尿液相比尿液EV样本中存在特异性富集的代谢物，且尿液EV携带的代谢物的肿瘤相关改变更加明显。但由于相关报道有限，且大多纳入的样本数量较少,因此直接使用体液样本和使用
10、体液来源的EV样本究竟孰优孰劣还有待进一步的评价。（二）EV携带的代谢物在各系统肿瘤中的研究1 .泌尿系统肿瘤：泌尿系统肿瘤的相关研究大多采用尿液样本，其中研究最多的是前列腺癌（prostatecancer,PCa脂质代谢物研究方面,一项研究分析了15例PCa患者和13名健康对照者尿液EV携带的代谢物，发现9种脂类的水平存在差异，其中磷脂酰丝氨酸18：1/18：1和乳糖神经酰胺d1.8:1/16：0的显著性最高，将这2种脂质与磷脂酰丝氨酸18：0/18:2进行组合，可达到93%的敏感度和100%的特异度311.另一项研究发现PCa患者尿液EV中磷脂酰甘油22:6/22:6明显较高，而甘油二酯1
11、6:0/16油和16:1/18:1以及许多甘油三酯却明显较假110而在其他小分子代谢物方面,有研究发现尿液来源EV携带的多种脂质和氨基酸在PCa和前列腺增生之间表现出明显丰度差异，且PCa患者尿液EV中硫酸脱氢表雄酮水平明显较高，这与PCa患者雄激素合成的潜在升高相一致320此外还有一项研究同时对尿液EV和血小板EV的代谢组学特征进行了分析，结果发现与对照组相比，前列腺切除术前患者尿液EV样本中的葡萄糖醛酸、5-磷酸核糖和异丁基-I-肉碱水平明显较低。此外该研究还发现了在尿液EV样本中特异性富集的代谢物Y谷酰基半胱氨酸,它在血小板EV和尿液样本中均未富集，这一发现可能有助于推测EV的来源300
12、除前列腺癌外，也有研究者对肾癌中EV代谢组学的诊断价值作了探究，研究发现肾细胞癌患者尿EV携带的溶血磷脂酰乙醇胺丰度明显低于正常对照1602 .呼吸系统肿瘤:EV携带的代谢物在呼吸系统肿瘤中的相关研究主要围绕肺癌展开，2项研究分别使用了血浆和胸腔积液样本。第一项研究发现，血浆EV所携带的包含7种脂质在内的特定组合能够对非小细胞肺癌和健康对照进行区分,ROC曲线下面积(areaunderthecurve,AUC)可达0.80以上33;随后另一项研究对胸腔积液中的EV进行了代谢组学分析,发现IEV比SEV更能区分恶性胸腔积液，于是研究团队继续探究了胸腔积液IEV中一组代谢物(苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂
13、酰胆碱35:0和鞘磷脂44:3）对肺癌的诊断价值，其AUC可达0.9534o3 .消化系统肿瘤:消化系统肿瘤研究主要采用的是血液样本。Zhu等35的研究证明了一组由3-尿昔酸、棕稠油酸、棕楣醛和癸酸异丁酯组成的EV携带的代谢物可预测食管癌复发，其AUC可达0.98。另一项在胰腺癌中开展的研究发现胰腺癌患者与健康对照者血清EV中有多种脂质存在明显差异,进一步分析还发现溶血磷脂酰胆碱22:0、磷脂酰胆碱14:0/22:2和磷脂酰乙醇胺16:0/18:1与肿瘤分期、CA19-9sCA242和肿瘤直径有关,且磷脂酰乙醇胺16:0/18:1还与患者的总生存期呈负相关36o此外，还有研究发现高丰度的EV鞘
14、氨酸、心磷脂、溶血磷脂酰丝氨酸和羟基脂肪酸以及较少的硫酸盐和酰基葡萄糖谷馅醇酯与肝癌密切相关374 .妇科肿瘤：一项乳腺癌相关研究收集了78例乳腺癌患者和30名健康对照者的IEV,利用靶向和非靶向质谱对其代谢组进行了表征，结果发现8种代谢物存的差异具有统计学意义，其联合诊断的AUC可达0.78。此外该研究还发现高浓度的溶血磷脂酰胆碱aC26：0和磷脂酰胆碱aaC38：5与乳腺癌较短的总生存期相关15o另外一项研究则是对完整的活细胞和组织中的EV直接进行了可视化和表征，结果发现乳腺癌组织内、组织边界和血管周围有大量的富集还原型烟酰胺腺瞟聆二核甘酸磷酸后勺EV,且其百分比与人类乳腺癌的诊断相关38
15、0此外还有研究探索了血浆EV代谢组学在子宫内膜癌中的诊断价值结果也提示患者与健康对照者的EV携带的代谢物水平存在差异39o5 .其他肿瘤：有研究发现与健康人群来源的EV相比，从头颈鳞状细胞癌患者血浆分离的EV中富含瞟畛代谢产物，并携带较高水平的腺昔。该研究还发现早期疾病和无淋巴结转移患者的EV中腺昔和5,鸟苗酸水平较高,而在晚期和淋巴结受累的患者中瞟岭代谢产物水平较低21,这一发现提示转移活性较强的患者肿瘤细胞代谢活动可能发生了改变，具有重要意义。此外，黑色素瘤患者的血清源EV代谢组学与健康对照组相比具有显著差异，其中磷脂酰胆碱16:0/0:0在黑色素瘤患者血清和黑色素瘤干细胞来源的EV中含量
16、较低26o综上，EV代谢组学能够灵敏和特异的反映肿瘤状态，在肿瘤诊断方面具有重要意义。三、EV携带的代谢物调控肿瘤进展的功能1 .促进囊泡摄取：EV可以通过多种不同的途径与靶细胞相互作用，代谢物尤其制旨质在这个过程中也发挥着非常重要的作用。一方面EV可以借助膜上的生物活性脂质与靶细胞表面的受体相互作用直接影响其生命活动40,41o另一方面EV还能通过被受体细胞摄取进而发挥作用42,目前有研究发现某些肿瘤来源的EV表面存在着如PS43,441.溶血磷脂酰胆碱45,46等标记,并且富含脂筏相关的脂质,能够促进EV被靶细胞摄取。2 .提供代谢原料：有多项研究发现，EV携带的代谢物能够作为原料被靶细胞摄取，调控肿瘤细胞的生命活动。例如一项研究发现肿瘤相关纤维母
