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1、2023核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识(最全版)摘要核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)技术在结核病与非结核分枝杆菌病病原学和耐药性诊断中的应用越来越多，为早期诊断、鉴别诊断和耐药鉴定提供了快速、准确的依据。然而，在实际应用中，临床医生对标本的选择、留取、送检时机及注意事项、报告结果的解读等的理解和掌握参差不齐，尚需规范化。本共识总结了核酸MALDI-TOFMS检测技术应
2、用于结核病和非结核分枝杆菌病诊断的临床适应证和标本采集注意事项，介绍了如何正确解读核酸MALDI-TOFMS技术鉴定分枝杆菌菌种和耐药性的报告结果，以进一步规范核酸MALDI-TOFMS技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用，提高临床诊断水平，指导临床开展早期精准有效的治疗。结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)估计，2021年全球有1060万例新发结核病患者，死亡近160万例，新增45万例耐多药/利福平耐药结核病患者。其中，我国新发78万例结核病患者，新增耐多药/利福平耐药结核病患者约3.3万例，是全球结核
3、病及耐药结核病高负担国家之一1-2;肺外结核占所有结核病的15%40%3-6,因其容易导致器官或组织功能性损伤和器质性障碍而成为近年来结核病领域关注的重点；全球由非结核分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteria,NTM)引起的疾病比例呈现上升趋势7-8,在很多发达国家，NTM病甚至超过了结核病9-10。我国的NTM分离率也逐年增高11-15,南方和沿海地区高于北方和内陆地区11,16。宿主及环境因素对NTM病的流行也有很大影响8,17-18。临床上以NTM肺病最为常见19,NTM肺病的临床表现、放射影像学特征和痰涂片抗酸杆菌染色检查特征与肺结核极其相似，且大多数NTM对常
4、用抗结核药物呈天然耐药或耐药率高11-12,需要经过数月至数年的漫长复杂的治疗，有时因不能耐受药物的不良反应，导致治疗不完全或再感染而复发20-22,对人类健康构成重大威胁，已成为全球关注的公共卫生健康问题。因此，准确快速诊断和鉴别诊断结核病与NTM病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。第一部分核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的基本原理与特点基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)技术是一种直接分析大分子的质谱技术
5、。来自生物样本的核酸、蛋白质、脂质等提取物与基质混合后置于合成金属板孔的芯片中，使得样本在基质中被晶体化。将该金属板芯片放入质谱仪中，氮气激光的短脉冲将在此轰击金属板，吸收能量后的基质将导致生物样本解离、蒸发并在气象阶段离子化。离子化分子在静电场中加速，喷射通过真空的金属飞行管直到抵达检测器，离子化分子的飞行速度取决于质荷比，其中相对分子质量小的离子抵达时间短于相对分子质量大的离子。基于以上原理，样本解离的离子根据其飞行时间而被分开，产生一系列由不同强度的质荷比峰组成的质谱结果，且每个样本产生一个质谱23。1996年，第一个MALDI-TOfMS试验成功鉴定出细菌24。自2010年以来，逐渐应
6、用于临床微生物检测领域，在分枝杆菌领域也有应用，但是绝大多数应用都是基于蛋白质的相对分子质量差异，而非基因序列多态性11,25-33o基于蛋白质的MALDi-TOFMS技术需要进行分枝杆菌培养，无法达到快速诊断的目的，因此，基于基因序列多态性的核酸MALDI-TOfMS技术应运而生。核酸MALDi-TOFMS技术是以核酸作为细菌鉴定的生物标志物34-35z基本原理是通过对多靶点基因片段进行多重PCR特异性扩增，去除脱氧核糖核苗酸后，进行各个位点的单碱基延伸反应，经处理后的延伸反应产物同质谱所需基质混合，放入飞行时间质谱仪中运行，每份样本会得到独特的指纹质谱图，经过判读后获得菌种及耐药信息。核酸
7、MALDI-TOfMS技术可以同时针对分枝杆菌的保守基因片段，例如16SrRNA、hsp65等基因的多态性进行设计，从而快速鉴定分枝杆菌菌种。同时，根据耐药相关的基因多态性进行设计，获得rpoBxkatGxgyrA、erm(41)等分枝杆菌相关的耐药基因突变结果。常见的基于核酸扩增技术的结核分枝杆菌检测均基于IS6110JS1081等位点进行扩增，选择其中的1个或2个，而核酸MALDI-TOfMS技术可以在此基础上考虑增加其他位点的多态性检测，例如内转录间隔区(internaltranscribedspace,ITS)、rpoB等基因,因此鉴定分枝杆菌的敏感度更高；而且由于有多基因结果的验证，
8、可以在提高敏感度的同时，保证结核分枝杆菌检测的特异度。同时，在耐药性检测方面应用范围更广，几乎覆盖了目前常用的抗结核和抗NTM病的药物，检测针对性强、准确性高。在飞行时间质谱仪检测的过程中，从激光发射到信号接收检测只需几毫秒，因此在短时间内对数百例样本同时进行检测分析，具有高通量、快速、灵敏、高分辨率、低成本等特点，且不依赖于荧光探针等荧光类试剂，检测周期短于一代和二代测序，对少量样本也能进行多基因多位点检测。通过提取生物样本中的核酸分子继而进行特异性扩增，实现单个核昔酸碱基的直接鉴定，无需培养，实现快速诊断，可以满足临床早期诊断并指导治疗的需求。表1简要概括总结了常用分枝杆菌病原学及其耐药性
9、鉴定的分子诊断方法的优劣势。1”0阡等0a0怆”于0为送S比B,出1应用同中险资通较低仅崎迸行原学的鉴定.不辍检测耐打性.*.*沼.试剂不JSiO交叉沔及 会出现Wa怪绪票所需样本大.怆霸的射割g点有*.点交.冼芬以较聚域.费时2厮方法施用优势实时英:定可授松赛W幡本,技术成熟，应用广泛,或寒度桁构Hflr均校高PCR技术校无需温度”厦循环保持工度恒定.对设笛费家不快速检jw分悚杆,闵可疑er基因芯片/区怪田计技ffiB.可一次兀成押建和个好为相关因位点的检利.SlSflIfO特R度均蛟术史凶维测序可同时怆富于4病原R生%.可检M巳卬射种位点以外的交交,可用于发现新的射割机IR向痴序技术对悻本
10、.没修和结事X试制.P肉制笊技术可险1所有的附的相关“因的突变类型.一代方库常作为分子为方UI蛇窝结里的要求扃.一代海序对的JK性酎杓的松和表型种福敬域哈舞培里不一致时的喳证手段测受赋MMMALDi高通，可一次性所1一线15物和大都分启用二线的福的耐杓H因位点,可很好区分络搐分枝杆*只1a!已知的酎杓“因位点，依族于-TOFMStsa和结摘分校HBLIlfJ蛟高的贡;由5,50度相拘R度可哈舞混合EG、A属性耐百、阿义交交耐丹机*发现已有研究证实，核酸MALDI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌及其耐药性具有较高的准确性。2017年，来自中国台湾的研究团队将此技术应用于鉴定结核分枝杆菌复合群和NTM
11、,结果表明该技术的检测限为5个拷贝数，同时检测耐药的敏感度和特异度都达到了较高水平34。有文献报道，通过对168株临床结核分枝杆菌分离株进行抗结核药物的耐药性分析，发现核酸MALDI-TOfMS技术检测结核分枝杆菌耐药性有很好的表现，大部分药物的检测结果与表型药物敏感性(简称药敏)试验结果具有很好的一致性36。针对复治结核病患者的结核分枝杆菌耐药性检测研究显示,核酸MALDi-TOFMS技术与液体培养药敏检测具有很好的一致性37;针对涂阴或无痰肺结核患者的支气管肺泡灌洗液样本的检测结果显示，核酸MALDI-TOfMS技术的敏感度和曲线下面积(areaundercurve,AUC)均优于Gene
12、XpertMTB/RIF和培养法38。来自西安市胸科医院的一篇研究报道，相比于高分辨率熔解曲线方法(high-resolutionmeltingcurve,HRM),核酸MALDI-TOFMS技术表现出更高的准确性39。核酸MALDI-TOfMS技术检测分枝杆菌及其耐药性具有较好的诊断价值和临床应用前景。为了规范核酸MALDI-TOFMS技术在分枝杆菌病诊断中的应用，结合中国临床证据及专家实践，在借鉴国际研究证据的基础上，解放军总医院第八医学中心、中国防腐杂志编辑委员会和中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学术部联合组织专家共同拟定核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病
13、和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识，供临床医生在临床诊疗时参考，并为将来进一步制定临床相关指南提供基础。第二部分共识制定的过程2022年3月，解放军总医院第八医学中心结核病医学部和中国防痍杂志编辑委员会依托中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学部组建核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识专家组。专家组成员必须满足以下条件：（1）担任中国防腐协会专业分会或中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会委员或中国防腐杂志编委、通信编委；（2）具有高级专业技术职称；（3）从事结核病临床、检验和基础研究工作10年以上，具有丰富的相关工
14、作经验，在结核病领域有较高的学术地位；（4）自愿参加专家组，能够全程参加专家共识的讨论与制定，并积极提出自己的意见和建议。专家组成员来自全国结核病专业诊疗机构，历时1年时间，对国内外核酸MALDI-TOfMS技术在结核病和NTM病诊断中的临床应用及进展进行了文献检索和复习，并对国内各地相关临床问题及应用经验进行了深入调查和相互沟通。虽然核酸MALDI-TOfMS技术作为一项新型技术在结核病和NTM病诊断中的临床应用研究较少，专家组多次召开专家讨论会，经过认真分析，反复论证，归纳总结，一致认为核酸MALDI-TOfMS技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性快速检测方面具有较好的临床诊断价值和应用前景，最
15、终达成一致意见，形成共识终稿O第三部分核酸MALDI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌菌种及其耐药性一、应用核酸MALDI-TOfMS技术鉴定分枝杆菌菌种目前，核酸MALDI-TOfMS技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个NTM菌种及其亚种，合计48个分枝杆菌菌种和亚种（表2）,几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌，可以满足临床实现快速鉴定分枝杆菌菌种的要求，为临床医务人员提供诊断参考。另外，随着临床实践的逐步积累，核酸MALDi-TOFMS技术可根据临床上未来可能出现的菌种予以增加鉴定。表2应用核酸MALDlTOFMS技术鉴定的分枝杆菌菌种或亚种导出到EXCEL序号中文名称拉丁文名称结核分枝杆菌复合群1结核分枝杆菌M.tuberculosis2牛分枝杆菌M.bovis3牛分枝杆菌BCGM.bovisBCG4田鼠分枝杆菌M.microti5非洲分枝杆菌M.africanum6卡内蒂分枝杆菌M.canetti7山羊分枝杆菌M.caprae8海豹分枝杆菌M.pinnipedii非结核分枝杆菌1鸟分枝杆菌M.avium2胞内分枝杆菌M.Intracellulare3莲建洞分枝杆菌M.yongonense4脓肿分枝杆菌M.abscessus5博莱分枝杆菌M.bolletii6马赛分枝杆菌M.massili
