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1、ICS67.120.10CCSX22NY中华人民共和国农业行业标准NYTXXXX-XXXX动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程TechnicalcodeofpracticeforisolationandidentificationofClostridiumperfringensfromanimalsXXXX-XX-XX 发布（送审稿）XXXX-XX-XX实施中华人民共和国农业农村部本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国
2、兽药残留与耐药性控制专家委员会归口。本文件起草单位：中国农业大学，中国兽医药品监察所。本文件起草人：王少林，赵琪，吴聪明，张纯萍，张仕泓，王鹤佳，周宇晴，徐士新，陈安杰，崔明全，李霆，程敏。动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程1范围本文件确立了动物源产气荚膜梭菌(CIOSiridiIanPelfrigens)分离与鉴定的程序，规定了样品采集与保存运输、分离纯化、筛查与鉴定、菌种保藏、生物安全要求的操作指示，描述了相应的试验方法。本文件适用于动物源细菌耐药性监测对动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中产气荚膜梭菌的分离和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成
3、本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.13食品安全标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验GBZT6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY1948兽医实验室生物安全要求通则NYf4141动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程3术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂或材料1.1.1 1要求除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GBZT6682规定的三级水，培养基按附录A配制或用商品化产品。1.1.2 2试剂4.2.1 灭菌液体石蜡。4.
4、2.2 PCR预混液(2PCRMasterMix)o4.2.3 50XTAE缓冲液。4.2.4 琼脂糖。4.2.5 DNAMarker(2000bp)。4.2.6 a-甄-4-羟基肉硅酸(HCCA)o4.2.7 甘油。4.2.8 3溶液制备1.1.1 1IXTAE缓冲液：取50XTAE缓冲液20mL,加水至IOOOmL。1.1.2 4琼脂糖凝胶:取琼脂糖L0g,于100mLIXTAE中加热，充分溶解。1.1.3 基质溶液：取a-鼠-4-羟基肉硅酸(HCCA),按说明书配制，或用市售商品。1.1.4 灭菌甘油:取甘油适量，121高压灭菌20111。1.1.5 4培养基制备4.4.1AmieS运送
5、培养基：按照附录A中A.1的规定执行。4.4.2液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)：按照A.2的规定执行。4.4.3胰月东-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSe)：按照A.3的规定执行。4.4.45%绵羊血琼脂培养基：按照A.4的规定执行。44.55%蔗糖脱脂乳保护剂：按照A.5的规定执行。4.5标准菌株产气荚膜梭菌毒素C型(ClOSiridiMnlpefngens,TypeC)CVCC60101o4.6材料4.6.1无菌脱纤维绵羊血。4. 6.2生化鉴定试剂盒或鉴定卡。5. 6.3细菌DNA提取试剂盒。6. 6.4磁珠保藏管。5仪器设备6.1 二级生物安全柜。6.2 冰箱：28,-20C或以下。
6、5. 3分析天平：感量0.01g。5.4 精密天平：感量0.001g。5.5 移液器：0.5LIOooL7. 6恒温培养箱。5.7厌氧培养装置。5. 8微生物生化鉴定系统。5.9PCR仪。5. 10高速冷冻离心机：离心速度12000rmin5.11 核酸电泳仪。5.12 电泳凝胶成像分析系统。5.13微生物质谱仪(MALDI-TOfMS)o6分离鉴定程序分离与鉴定流程见图1。图1产气荚膜梭菌分离与鉴定流程7样品采集与保存运输样品采集与保存运输按照NY/T4141的规定执行。8分离纯化8.1 预增菌8.1.1 动物直肠/泄殖腔拭子取样品液2OOL,置FTG培养基2mL中，混匀，液体石蜡封固，36
7、C(+1)厌氧培养20h24ho8.1.2 新鲜粪便、肠道内容物取样品适量，置FTG培养基2mL中，混匀，液体石蜡封固，36(1)厌氧培养20h24ho8. 2增菌取预增菌液ImL、约50的TSe琼脂培养基9mL,倾注平皿，缓慢旋转混匀，室温凝固。再加入约50的TSC琼脂培养基IOmL,室温凝固，正置，36(1)厌氧培养20h24h.8.3纯化挑取圆形黑色单菌落，接种5%绵羊血琼脂培养基，36C(lC)倒置厌氧培养20h24h。挑取有溶血环、表面光滑菌落，接种5%绵羊血琼脂培养基，36(1)倒置厌氧培养20h24h,纯化，备用。9筛查与鉴定9.1筛查9.1.1形态学检查取纯化菌落，按照GB47
8、89.13规定执行。9.2鉴定9.2.1通则生化鉴定、PCR鉴定和质谱鉴定3种方法任选其一。9.2.2生化鉴定按照GB4789.13规定执行，也可以使用生化鉴定试剂盒、鉴定卡或微生物生化鉴定系统鉴定。9.2.3PCR鉴定9.2.3.1模板制备取新鲜的纯化菌落，加灭菌水ImL,煮沸IOmin,冰浴冷却，12000面皿离心3111抽。取上清液，备用。或使用细菌DNA提取试剂盒提取DNA作为模板。产气荚膜梭菌标准菌株作为阳性对照，水为阴性对照。9.2.3.2引物引物序列及扩增片段长度见表k表1产气荚膜梭菌的PCR引物序列及扩增片段长度细菌引物序列扩增片段长度，bp产气英膜梭菌上游引物（CPa-F）:
9、5-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3下游引物（Sa-R）:5-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3,3249.2.3.3反应体系反应体系(30L)见表2。表2PCR反应体系试剂体积，L2PCRMasterMix15上游引物(10molL)1下游引物(10moIL)1水CddH2O）12模板19.2.3.4反应条件94预变性5min；94变性30s,55退火30s,72延伸30s,30个循环；72延伸10min。9.2.3.5电泳取PCR扩增产物，于1%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析。9. 2.3.6结果判定扩增条带大小符合324bp的为阳性。阳性扩增产物必要时测序比对鉴定
10、，相似度不低于99%。产气荚膜梭菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果见附录B中B.1和B.2。10. 2.4质谱鉴定11. 2.4.1菌样制备挑取单个新鲜纯化菌落，均匀涂布于靶板样品孔中，室温干燥。吸取1L基质溶液滴于样品上，混匀，室温干燥。标准菌株的新鲜菌落同法操作。12. 2.4.2仪器校准检测样品前，应对微生物质谱仪进行校准。13. 2.4.3测定取制备好的样品靶板，置质谱仪靶板槽中。编辑样品信息后，进行谱图的数据采集。14. 2.4.4结果判定微生物质谱仪自动完成谱图的比对和鉴定。以不同分值显示结果，鉴定分值达到种水平可信即可。产气荚膜梭菌毒素C型标准菌株质谱鉴定谱图见附录C。10
11、菌株保藏取新鲜纯化菌，加入含有5%无菌脱纤维羊血的FTG培养基制成菌悬液，与灭菌甘油溶液混合，使甘油终浓度为20%40%;或加入磁珠保藏管；或加入5%蔗糖脱脂乳保护剂，冻干。-20或以下保藏。11生物安全要求实验室设施设备、人员防护及实验的安全操作、实验废弃物和菌种的处理应符合GB19489和NYb1948的要求。附录A（规范性）培养基A.1Amies运送培养基A.1.1成分氯化钠3.0g磷酸二氢钾0.2g磷酸氢二钠1.15g氯化钾0.2g氯化镁0.1g硫代乙醇酸钠.0g氯化钙0.1g琼脂7.5g水IOOOmLA.1.2制法将A.1.1中各成分加入水中，混匀，加热煮沸至完全溶解，调节PH至7.
12、3O.l,12Ie高压灭菌15min,备用。A.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）A.2.1基础液胰蛋白陈15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.5g刃天青0.001g琼脂0.75g水1000mL将A.2.1中各成分加入水中，混匀，调节PH值至7.10.2,121高压灭菌15min,备用。A.2.2制法基础液D-环丝氨酸1000mL80mL将各成分混匀，备用。A.3胰豚-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（TSC）胰陈15.0g大豆陈5.0g酵母粉5.0g焦亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁核1.0g琼脂15.0g水IOOOmlA.3.1基础液将A.3.1中各成分加入
13、水中，混匀，调节PH值至7.30.2,12Ic高压灭菌15min,备用。A.3.2制法基础液D.环丝氨酸IOOOmL80mL将各成分混匀，备用。A.45与绵羊血琼脂培养基A.4.1成分蛋白陈IO-Og牛脑浸粉12.5g葡萄糖2.0g牛心浸粉5.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠2.5g琼脂15.0g水IOOOml将A.4.1中各成分加入水中，混匀，调节pH值至7.40.2,121C高压灭菌15min。冷却至约50,备用。A.4.2制法基础液IOOOmL无菌脱纤维绵羊血200ml将各成分混匀，倾注平板，备用。A.55与蔗糖脱脂乳保护剂A.5.1成分IO-Og5.0 g IOO mL脱脂乳蔗糖水将人.5
14、.1中各成分混匀，112高压灭菌20111,备用。附录B（资料性）产气荚膜梭菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果8.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图B.1。2000bpIOOObp750bp 500bp 250bpIOObp12345678M9标引序号说明：M-2000bp DNA Marker：1-7-为产气荚膜梭菌：8”为阳性对照(CVCC 60101)；9-为阴性对照(ddHzO)。图B.1产气荚膜梭菌PCR产物电泳图8.2 目标片段测序结果见如下。GctaatgttactgccgttgaccgcgcaggacatgttaagtttgagacttttgcagaggaaAGAAAAGAAcAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTnTATGCTgatatcttaaaaaacaaagattttaatgcatggtcaaaagaatatgcaagaggttttgcTaaaacaggaaaatcaatatactatagtcatgctagca
