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1、2022利用胚胎培养液中游离DNA进行无创植入前遗传学检测的研究进展(全文)摘要胚胎在体外生长过程中会向培养液中释放游离DNA(cell-freeDNA,CfDNACfDNA指游离于细胞外的DNA片段,是胚胎发育过程中细胞生理性凋亡的产物。利用CfDNA进行无创胚胎植入前遗传学检测(non-invasivepreimplantationgenetictesting,niPGT)具有无创、操作简便等优点，已在胚胎染色体非整倍体检测及单基因疾病诊断方面取得了初步进展。然而，目前niPGT临床应用的有效性、母源污染和CfDNA来源等问题仍存在争议。本文对niPGT在临床方面应用现状及CfDNA来源进
2、行综述，并对其局限性及未来应用前景提出观点，为niPGT应用于临床实践提供参考。【关键词】受精，体外；胚胎游离DNA;无创胚胎植入前遗传学检测；废弃培养液近年来，由于生育年龄推迟、不良生活方式和环境污染等因素导致生育率下降和不孕不育患者越来越多1-2,需要借助辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology,ART)助孕的高龄患者明显增加。随着母亲年龄的增长，自然流产和胚胎非整倍体风险也在升高3-4,部分胚胎种植失败和反复自然流产主要是源于胚胎的非整倍性染色体异常5,在移植胚胎前鉴定并排除非整倍体胚胎是辅助生殖领域面临的巨大挑战。目前通过胚胎植入前染色体非整倍体检测(
3、preimplantationgenetictestingforaneuploidies,PGT-A)已成为检测胚胎染色体整倍性的常用方法，然而PGT-A需要配备昂贵的医学设备、操作繁琐及需要有经验的胚胎学家，阻碍许多生殖中心PGT-A项目的开展；同时PGT-A需要对滋养外胚层(trophectoderm,TE)活检，活检是否会对胚胎的后续发育造成潜在的威胁及其远期影响仍需进一步验证6o止匕外，体外受精(invitrofertilization,IVF)的人类囊胚中有高达30%40%为嵌合体7,胚胎嵌合体的存在会导致PGT-A检测的准确性降低或误诊，使PGT-A检测的结果不能完全代表整个胚胎的
4、染色体拷贝数及其最终形成的胎儿的染色体是否正常8,这些因素增加PGT-A检测风险的同时也限制了IVF的受益人群。寻求无创、安全、准确有效的胚胎染色体检测方法及胚胎质量评估方法已引起生殖医学工作者的高度重视，成为当前临床研究的热点和难点。2013年StigIiani研究团队首次在囊胚废弃培养液Spentculturemedia,SCM)中检测到低浓度的基因组DNA(genomicDNA,gDNA)和较高浓度线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)90同年Palina等10首次报告了在囊胚腔液中检测到来自胚胎的游离DNA(cell-freeDNA,CfDNA由此，一种新型的利用
5、SCM中CfDNA进行无创胚胎植入前遗传学检测(non-invasivepreimplantationgenetictesting,niPGT）应运而生，使得niPGT迅速成为生殖遗传领域的新热点。尽管目前对niPGT的研究众多，但是关于niPGT应该怎样在临床精准应用还存在争议，获益人群有哪些，以及存在的问题仍需进一步探讨。本文拟对niPGT在临床方面应用现状及CfDNA来源进行综述，并对其局限性及未来应用前景提出了一些观点，为niPGT这一新技术广泛应用于临床实践提供参考。一.培养液中CfDNA的来源及产生的生物学机制niPGT的一个难点在于对培养液中CfDNA的细胞溯源，这直接关乎无创检
6、测结果的准确性。有研究提示有胚胎的SCM比相同条件没有进行胚胎培养的液体中检测到更多数量的CfDNA,表明SCM中CfDNA是由胚胎释放到培养液中的110IVF后的胚胎在细胞分裂生长过程中，随着细胞的新陈代谢，会有大量CfDNA扩散到SCM中。然而，目前对于SCM中CfDNA的来源还没有足够的了解。有研究结果提示CfDNA来源于胚胎发育过程中凋亡和坏死的细胞11L囊胚在人工皱缩过程中使用的激光脉冲造成的细胞损伤12以及细胞有丝分裂过程1302021年乔杰研究团队与汤富酬团队合作利用DNA甲基化追溯囊胚培养液中CfDNA细胞来源该研究对194例体外培养胚胎的培养液进行微量DNA甲基化组测序，研究
7、结果显示培养液中CfDNA细胞来源包括囊胚细胞、颗粒细胞和极体细胞；同时CfDNA各成分比例进行了深入的对比分析后显示：33%培养液中CfDNA来源仅为囊胚细胞,12%培养液中CfDNA来源仅为颗粒细胞,4%培养液中CfDNA来源仅为极体细胞,且33%培养液存在严重母源污染140尽管目前对SCM中CfDNA的来源有了初步的研究，但是我们需要明确SCM中检测到的CfDNA,是由生理还是病理过程所释放的；不同质量的胚胎CfDNA的来源及比例是否相同；SCM中CfDNA的精确来源及每种来源的DNA究竟能够在多大程度上独立地反映胚胎的遗传学状态有待于进一步的研究。SCM中CfDNA产生的生物学机制目前
8、还不是太清楚，推断它可能是胚胎在分裂和发育过程中细胞凋亡或无核的胚胎碎片降解内源性DNA通过透明带渗透到胚胎培养液中15,是胚胎对异常染色体的一种自我校正机制16-17oniPGT与滋养层细胞活检结果的一致性niPGT能否在临床中广泛应用的关键问题是SCM中DNA的检测结果是否能够反映胚胎的遗传学状态。有研究者对niPGT的临床应用仍存疑问，因为niPGT与胚胎活检的结果一致性方面存在矛盾18oHanson等19对104枚囊胚同时进行niPGT-A和TE活检结果显示,有42枚(40.4%)两种方法检测结果不一致。一项对比胚胎CfDNA与TE活检对囊胚非整倍体检测结果一致性的研究中显示在115枚
9、囊胚中两者检测结果的一致率为78.7%、敏感度为94.5%、特异度为71.7%20o另一项研究显示,CfDNA进行染色体非整倍性检测的结果与TE活检结果不一致的比例为67%11,分析两种检测方法结果不一致的原因为91.7%囊胚为嵌合体，其不一致的结果主要是母源DNA在培养液中所占的比例比较高。2021年Yin等21研究显示SCM-全胚(19/59)和TE-全胚(52/75)的完全一致率分别为32.2%和69.33%,SCM的诊断效率为较低的敏感度、阳性预测值、阴性预测值、总体诊断准确性和较高的阴性似然比。造成niPGT不一致的原因可能是用于无创基因检测的胚胎体外培养过程中都是单个培养，每个胚胎
10、的培养液滴仅2030L,其含有的CfDNA成分也是微量的，微量的CfDNA的提取和分析是极其困难的，虽然可通过全基因组扩增(wholegenomeamplification,WGA)技术增加DNA含量用于后续遗传学分析，但敏感度仍有待提高，且存在扩增偏移、等位基因脱扣(alleledrop-out,ADo)等导致的假阴性结果。遗传物质正常的胚胎由于染色体的嵌合现象也可能导致CfDNA的改变,易造成假阳性结果。然而，上述的研究结果在现有的文献中也有相反的结论，一项研究结果显示SCM中CfDNA检测的囊胚染色体整倍性和染色体拷贝数的一致率均高于TE活检，通过CfDNA检测与整个囊胚检测结果的符合程
11、度比TE活检具有较好的准确性和可靠性,CfDNA能够准确地代表囊胚的染色体状态，为检测囊胚染色体整倍性提供了新的方法22oJiao等12观察到SCM中CfDNA检测与滋养外胚层活检对相同囊胚标本的临床一致率分别为90%和86%,两者对囊胚核型的一致率均为76%o止匕外，CfDNA对囊胚染色体重排检测的临床一致率为100%,其结果表明，SCM中CfDNA进行囊胚染色体筛查结果是有效的，并且实现了高分辨率、全面的染色体倍性检测。XU等23收集IVF发育到第3日至第5日的42枚胚胎的培养液，扩增其中的DNA片段，并将各片段通过序列比对定位到不同染色体上，通过不同染色体上片段数目的多少，来判断胚胎中染
12、色体数目。结果表明，SCM中CfDNA检测方法成功判断出了21枚染色体数目正常的胚胎和15枚染色体数目不正常的胚胎，其检测的特异度为84%,敏感度为88.2%,阳性预测值为78.9%,阴性预测值为91.3%,检测结果的敏感度、阳性及阴性预测值也证实其应用于临床染色体检测的可行性。Rubio等24研究团队牵头开展了一项多中心的随机对照试验研究，对全球8个生殖中心的1301份囊胚的培养液CfDNA进行染色体整倍体分析，结果显示niPGT-A与TE活检的一致性为78.2%、敏感度为81.7%、特异度为77.4%、阳性预测值为75.0%、阴性预测值为83.6%,提示SCM中的cfDNA检测与TE活检结
13、果高度一致。2021年曹云霞团队通过niPGT在染色体拷贝数嵌合胚胎中的应用价值研究中显示，对于染色体嵌合的囊胚培养液的检测结果与全胚胎检测结果显示出100%的一致性25,高于TE活检结果，SCM中的CfDNA对胚胎更具有代表性，其原因为SCM中的cfDNA同时来自内细胞团和滋养外胚层，而传统的滋养层活检无法规避嵌合体的问题。各个研究之间所报道的成功率差异可能是由于处理、分析和报道数据方面的差异所致，染色体拷贝数的可能会受到不同技术方法和生物信息工具的影响。总之，评估利用培养液CfDNA进行niPGT-A的研究表明，这项技术可以获得诊断结果这一临床要求，但在大多数情况下，结果的一致性相对较低，
14、对于临床应用而言是不可被接受的；目前的文献表明，从培养液中获得的结果与胚胎活检的细胞遗传学结果的不一致的原因，可能源于SCM中CfDNA产量低、核酸完整性差、潜在的胚胎嵌合和母源污染260三.影响培养液中CfDNA浓度的因素1.患者年龄及胚胎质量对培养液中cfDNA浓度的影响：胚胎在体外生长过程中会向培养液中释放cfDNA,CfDNA浓度与胚胎的质量与患者年龄相关。有研究检测了800枚IVF胚胎SCM,结果表明胚胎发育至第2日就开始向培养液中释放大量CfDNA,且SCM中CfDNA浓度与胚胎形态和女性年龄相关，形态学评分较差到评分中等的获得的培养液样品中CfDNA的浓度显著高于优质胚胎，35岁
15、以上的女性胚胎培养液中CfDNA含量较年轻女性显著增加9,产生这种现象的原因可能与胚胎的分裂程度、胚胎细胞的凋亡以及机体代谢有关。Rule等27在囊胚液CfDNA与第5日囊胚形态关系的研究中观察到CfDNA存在于囊胚液中，可以定量测定,并与囊胚质量呈正相关。产生这种现象的可能原因为CfDNA作为非整倍体细胞的产物，而非整倍体细胞是高质量胚胎通过自我校正释放的凋亡细胞；因此较高的CfDNA浓度是高质量囊胚的标志物。2.培养液类型及培养微滴体积对CfDNA浓度的影响：培养液是胚胎存活和发育的外环境，在不影响胚胎发育的情况下，优化胚胎培养体系获得理想的CfDNA浓度是进行niPGT-A的重要环节，不
16、同品牌的商业培养液是否会影响胚胎释放的DNA数量和完整性,目前还存在争议。2020年一项大规模多中心随机对照研究比较了不同培养基之间CfDNA浓度的差异，研究中来自8个生殖医学中心使用4种不同的序贯或单一培养基，以及培养基中添加两种不同比例（5%和10%）的白蛋白，显示不同类型的培养基对阳台CfDNA的浓度及结果的准确性没有显著的影响24,这些研究支持了胚胎CfDNA分析在不同IVF实验室潜在的适用性。同时该研究也表明10L的单微滴培养液体进行囊胚培养后第5日囊胚形成率及CfDNA浓度最高，少量培养液有助于提高第5日的成囊率，推测可能是胚胎自分泌过程产生的有益分子可能促进胚胎发育；同时在较小体积中进行胚胎培养，可以避免过度稀释胚胎释放的DNA,最大程度地减少抑制性培养基成分的数量。但是有研究者也提出长时间微量的单微滴培养液对胚胎生长发育是否有影响15O因此，未来需要进一步对培养条件和
