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1、2023胃癌腹腔分子残留病灶的诊断方法摘要腹膜转移是胃癌最常见的转移形式，是主要致死原因之一。部分患者在手术时往往存在腹腔微小转移灶，这会导致胃癌患者术后的复发转移，因此要积极开展胃癌腹膜转移的防治。分子残留病灶是指经过治疗后，传统影像学或其他实验室方法不能发现，但可通过液体活检发现的肿瘤来源分子异常，代表肿瘤持续存在和临床进展的可能。近年来，基于循环肿瘤DNA检测分子残留病灶逐渐成为了腹膜转移防治领域的研究热点。本课题组建立了胃癌分子残留病灶分子诊断的新方法，并对该领域研究成果进行了评析。实体肿瘤分子残留病灶(molecularresidualdisease,MRD)是指经过治疗后，传统影像
2、学或其他实验室方法不能发现，但通过液体活检发现的肿瘤来源分子异常，代表肿瘤持续存在和临床进展可能口。基于循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,CtDNA)来判断分子层面的残留病灶情况，并提供预后和预测的指导信息，是当前实体肿瘤的研究热点。目前，最成熟的应用领域是非小细胞肺癌，TracerX研究证实了CtDNA作为MRD检测的可行性，并评估了MRD检测对非小细胞肺癌术后复发的预测价值2。实体瘤患者检出MRD,代表癌细胞在体内持续存在,癌症复发的风险较高。胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，胃癌的MRD研究处于起步阶段，胃癌腹膜转移是胃癌最常见的转移形式，也是导致患者死亡的主要原因之一
3、。初诊时胃癌患者的腹膜播散率为14%;40%60%的进展期胃癌患者，腹膜是术后首先复发的部位。临床研究表明，病理浆膜侵犯的患者（T3或T4期）施行手术时，腹腔内往往存在肉眼难以发现的微小转移灶4。因此，积极开展胃癌腹膜转移的防治，无疑将有助于进一步提高胃癌整体疗效。一、胃癌腹膜转移的危险因素和机制胃癌腹膜种植转移的过程包括血行转移、淋巴转移以及播散转移，血行转移和淋巴转移在不同肿瘤中虽然存在差异，但腹膜播散转移是胃癌具有特征性的现象5-6。既往对腹膜转移的相关临床病理的风险因素研究较多，具有如下风险因素的胃癌患者发生腹膜转移的风险显著增加：（1）TNM分期中T3、T4期和淋巴结转移阳性；（2）
4、淋巴结外浸润；（3）胃癌Borrmann分型为m、IV型；（4）Lauren分型为弥漫型7-8。但是，腹膜转移的具体机制并未阐明，种子-土壤假说提出已有多年，目前依然是最为普遍接受的理论之一9。研究表明，几个连续的过程参与了胃癌的腹膜转移进程：浸润浆膜的胃癌细胞，尤其是弥漫型胃癌细胞，或者手术时从腹腔脱落的肿瘤细胞，形成最初种子。癌细胞在腹腔内播种和存活、黏附于腹膜、通过基底膜侵入腹膜下组织种植于土壤，增殖并伴随血管新生。事实上，胃癌腹膜转移的实质是细胞迁移、黏附、侵袭及上皮间质转化和血管生成的过程9。很多分子生物学标志物，包括上皮标志物、肿瘤相关抗原、血管生成中的抗原和上皮间质转化过程中的分
5、子等，都在腹膜转移中有相应的应用研究。使用反转录PCR检测腹腔灌洗液癌胚抗原mRNA也是一种有意义的探索。但是mRNA存在检测费时、灵敏度不稳定和不易普及等缺点，使其临床应用受限10。二、腹腔MRD的检测和意义绝大多数液体活检研究都聚焦在外周血里的CtDNA,而实际上外周血之外的其他体液中也含有CtDNA,这些CtDNA在特定场景中可能有着比血浆CtDNA更多的优势。CtDNA除释放到外周血外，还可以释放到与肿瘤组织直接接触的各类体液中，如尿液、脑脊液、胸水和腹水等11。胃癌的腹腔环境与癌种植转移的关联研究表明，腹腔中的游离肿瘤细胞，与血液循环途径相比,更直接和丰富,理论上有着更高含量的ctD
6、NA12o另外,去除了血液中白细胞释放的DNA片段的干扰才佥测起来也更容易、准确。将非血液来源的体液中CtDNA的检测与血浆和组织的检测综合起来，共同制定精准的个体化诊疗方案，可能会给患者带来临床获益。因此，本课题组应用了一种基于二代测序的超低频突变检测技术nMutationCapsulewl个体化选取20个左右肿瘤特异性突变,对胃癌患者术中留取的腹腔冲洗液中的细胞沉淀进行检测。我们依据选取突变位点的个数、肿瘤组织中的突变频率、腹腔冲洗液中的测序深度、各个突变在腹腔冲洗液中的突变频率等信息，建立了腹腔游离肿瘤细胞比例模型，预测胃癌术后腹膜复发转移的风险。我们将该方法应用于胃癌患者腹腔冲洗液的检
7、测中，结果显示：其在术后腹膜播散的预测方面表现出较为理想的预测效能，灵敏度为100%,特异度84%邛日性预测值70%,阴性预测值100%。在本研究的同一人群中,肿瘤细胞比例模型的灵敏度高于临床高危因素（细胞学阳性和病理T4期此外，结合临床高危因素后，肿瘤细胞比例模型对术后腹膜播散的预测效果得到了进一步的改善，在病理T4期患者中应用的灵敏度为100%,特异度86%,阳性预测值为81%o由此可见,肿瘤细胞比例模型能够对病理T4期胃癌患者术后腹膜转移风险的评估提供重要帮助13o总之，对肿瘤细胞比例阳性患者进行早期的临床干预治疗，从降低腹膜播散发生率的角度，来提高胃癌的总生存期，将对局部进展期胃癌患者
8、总体预后水平的提高具有重要的意义。三、胃癌MRD检测的困难和发展方向1.胃癌外周血CtDNA检测的难点：每例患者的实体肿瘤类型不一样，是自身所特有的，而且每例患者个体中仅携带非常少量相同的基因突变，这意味着，设计检测用的基因位点组合（panel）难度大，除了二代测序技术相对较大的panelz目前能做的便是开发个性化的MRD检测panel;实体肿瘤释放到外周血中的CtDNA含量一般非常地少，低于1%,这意味着，实体肿瘤CtDNA的检测需要更高的检测灵敏度。2.采用CtDNA检测MRD的技术路线：采用CtDNA检测MRD目前主要有两条技术路线即tumor-informed（基于肿瘤组织测序的CtD
9、NA个性化定制方案）和tumor-agnostic（仅基于血浆检测的固定panel）14otumorinformed路线（个性化panel）:已知的panel能够覆盖的位点相对比较有限，除了在单点上增加灵敏度之外，可以通过增加更多有潜力、可监控的阳性位点来增加整个样本的敏感性。通常先采集患者肿瘤组织进行全夕卜显子测序（wholeexomesequencing,WES）检测，针对每例患者选取肿瘤特异性的克隆位点进行个性化定制二代测序panel（或使用多重PCR方法），在监测时提取血浆中的CtDNA进行超高深度测序。tumor-agnostic路线（固定panel）:用固定panel设计覆盖的位点
10、虽然多，但是针对每例患者的有效监控位点数量不及tumor-informed路线方法，所以很多采用此策略的检测方法加入表观基因组学特征提高检测灵敏度。鉴于甲基化在肿瘤发生早期已有显著变异、变异位点数目丰富，这些表观基因组标记在不同患者之间甚至在不同癌症之间更相似，使其成为新MRD检测方法的可能15。3.其他检测方法：有研究显示,CD01甲基化检测可用于检测腹膜转移，灵敏度和特异度高达74.2%和96.5%16o另有研究通过胃癌腹膜转移灶对照胃原发灶的分子特征，分为两个主要的分子亚型：间质样（M型）和上皮样（E型1对化疗反应一般的间质样（M型）患者往往高表达免疫检查点T细胞免疫球蛋白和TIM-3,
11、其配体galectin-9,T细胞活化的V域Ig抑制剂（VISTA）和TGF-,为潜在的治疗性免疫靶标17o如ATTRACTION-2的全球数据提示，有腹膜转移的患者似乎并不能从免疫治疗中获益；但是日本亚组分析提示，即使患者有腹膜转移，也依然可以从免疫治疗中获益18。因此,在临床实践中，胃癌腹腔MRD患者能否从免疫治疗中获益也具有进一步探究价值。4.发展方向：我们认为，胃癌腹膜转移未来最有意义的方向之一，将是探索创建一个基于腹腔游离肿瘤细胞检测的胃癌预后预测+辅助治疗用药指导模型，指导术后辅助化疗的用药选择，并筛选出在胃癌术后辅助化疗、靶向治疗，以及免疫治疗中的获益人群，将胃癌腹膜种植转移的高
12、危人群筛选出来，早期干预，从而提高胃癌的总体预后。在未来，基于MutationCaPSUIe对胃癌术后患者MRD进行检测，实现对患者腹膜种植转移风险分层，从而根据结果个体化选择是否采用腹腔内化疗辅助治疗的新型诊疗策略拥有较广泛前景。参考文献1 ChinRLChenKzUsmaniAzetal.Detectionofsolidtumormolecularresidualdisease(MRD)usingcirculatingtumorDNA(ctDNA)J.MolDiagnTher,2019,23:311-331.DOI:10.1007s40291-019-00390-5.2 AbboshC1B
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