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1、锦鲤疱疹病毒（KHV）荧光PCR检测试剂盒说明书试剂简介锦鲤疱疹病毒（KHV）荧光PCR检测试剂盒主要感染当年草鱼种和青鱼，死亡率可达80%以上。其它淡水鲤科鱼，如鱼、鳗鱼、鲫鱼、鲤鱼感染后没有临床症状，但可以携带病毒到处传播。该病在水温高于20以上时流行，2528C为流行高峰。常见的临床症状为眼突出、体色发黑，口腔、鲤盖和鳍条基部出血。撕开表皮，可见肌肉出现点状或块状出血。剖检腹腔，可见肠道充血，肝、脾充血或因失血而发白。病原为草鱼呼肠孤病毒（GraSSCarPreovirus,GCRV）,是水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus）的成员。病毒为直径70nm的球形颗粒，有双层衣壳，无囊膜
2、，含有11个片段的双链RNA。根据片段长度大小分为大（LKL2、L3,大小在4.Okb3.7kb）、中（M4、M5、M6,大小在2.52.Okb）、小（S7、S8、S9、SlOxSll,大小在L6LOkb）三组。在不同地区存在抗原性、核酸电泳图谱、对细胞的敏感性和对鱼的毒力都有一定差异的毒株。多年研窕已经确定的有二个典型的代表株：GCRV-873为湖南株，能在CO、CIK等细胞中大量增殖并出现CPE,症状以内脏出血为主；GCRV-9014为湖北株，能在CIK、CO细胞中大量增殖，但不产生CPE,症状以肌肉出血为主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到8现。为了适应草
3、鱼出血病（GCRV）快速检测和疫病研究的需要，本公司严格依据SN/T3584-2013草鱼出血病检疫技术规范规定的检测GCRV-9014株病毒的引物序列及其循环参数等技术标准，在本公司严谨的产品质量保证体系管控下生产和质检。确保本试剂盒满足标准的检测要求。本试剂盒具有快速灵敏、特异、准确、安全、操作简单、应用广泛等特点及优点。2、试剂盒组成试剂盒组成包括核酸扩增试剂。具体组成参见表1：表1：试剂盒组成（50test/盒）试剂盒组成成分体积核酸提取试剂：核酸裂解液15ml2管核酸扩增试剂：DEPC水GCRV-9014RT-PCR反应液前混合物阴性对照GCRV-9014阳性对照IlnIXI管750
4、LXl管60LXl管ImIXI管IinIXI管取新鲜鱼类组织脏器（肝、脑、腺肾）2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加5mlPBS混匀，2OOOrAnin离CMOmin取上清转入无菌离心管中备用。或取有可疑细胞病变的细胞悬液用于检测。存放：研磨后的样本在2-8C条件下保存应不超过24h；-70C以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）,运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。4、一步法RT-PCR检测操作方法样本的处理（在样本制备区进行）：取n个灭菌的L5mLEppendorf管，其中n为被检样品与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），做标记。（注：试剂盒中的阳性对
5、照直接作为PCR检测的模板，无需提取核酸）每管加入600L裂解液，分别加入被检样本和阴性对照各200L,一份样本换用一个吸头，再加入200L氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀），于412000r/min离C?15min。取与4.1.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入500L异丙醇（-20预冷），做标记。吸取4.1.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500L,不能吸出中间层，颠倒混匀。于4、12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清,倒置于吸Zl维匕沾干液
6、体（不同样品须由吸水纸不同地方沾书；力叭600L75%乙醇，颠倒洗涤。于4、12000r/min离心IOmin（EPPendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。4OOOr/min离心IoS（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min,不能过于干燥，以免RNA不溶。加入11LDEPC水，轻轻混匀，濯蟀管壁上的RNA,2000r/min离口5s,冰上保存备用。注：提取的RNA须在2
7、h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70C冰箱内。、试剂准备扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：从试剂盒中取出相应的一步法RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶,在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需一步法RT-PCR检测总数为n,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见下表2。提取的RM须生2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70C冰箱内。【也可参照病毒RNA柱式提取试剂盒说明书（货号：HB-QPCR-Ol）使用，更方便快捷提取核酸】。根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个一步法RT-PCR管中
8、各分装15UL,转移至样本处理区。加样（在样本处理区进行）：在各设定的一步法RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4.L1.7中制备的RNA溶液各IoUL,螺管盖，500r/min离心30s。、检测（在检测区进行）将4.2.2中离心后的PCR管放入PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置如下：第一阶段：42/30min：第二阶段：94/4min；第三阶段：94/1min,55/1min,72oClmin,30个循环；第四阶段，72/8min；第五阶段，4保存。、琼脂糖电泳用电泳缓冲液制备L5%的琼脂糖凝胶平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将IOUL样品PCR扩增产物和相应电泳上样缓冲液(LoadingBuffer)按比例混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约0.5h,当漠酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下或凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增初预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录。5、结果判定步法RT-PCR后阳性对照出现一条32ObP的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品在相应320bpDNA位置上有带，可判阳性。6、相关技术信息F:5-acgtgcgattggaagagctt-3R:5-agttctcaaagctgagacag-3
