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1、2022先天性无痛无汗症家系的致病突变鉴定及产前基因诊断（全文）摘要目的鉴定先天性无痛无汗症（CIPA）家系的致病突变，为先证者家庭提供遗传咨询和产前基因诊断。方法收集2017年12月至2021年7月中国医学科学院募集的QPA先证者19例及其母亲再次妊娠时的胎儿20例。通过靶基因Panel测序和Sanger测序的方法鉴定先证者的致病突变，针对先证者致病突变,通过聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序的方法对先证者父母及家系中的高风险胎儿进行基因型鉴定；基因型与先证者相同的胎儿为患儿。结果19例CIPA先证者的基因型中，NTRKl双等位基因突变的复合杂合子14例，NTRKl基因突变的纯合子3例
2、，母源单亲二体（UPD）2例。19例CIPA先证者中共检测出22种NTRKl基因变异，其中9种错义突变,1种无义突变，4种微缺失或微重复介导的移码突变，7种内含子变异导致的剪接异常以及1种NTRKl基因的大片段缺失变异。19个CIPA家系的20例CIPA高风险胎儿中，检出正常基因型胎儿4例，致病突变携带者11例，NTRKl双等位基因突变复合杂合子患儿5例。2例先证者为母源NTRKl突变等位基因UPD的家系中，患儿的父母再次生育时，胎儿均为NTRKl基因突变携带者，未见母源UPD再次发生。结论本研究为ClPA家系提供了精准的遗传咨询和产前基因诊断为QPA家系的健康生育提供了重要保障。讨论1. C
3、IPA患者致病变异的检测与热点突变：本课题组在截至目前所募集的82个CIPA家系中的研究结果表明,CIPA患者的NTRKl基因变异类型多样且存在热点突变，其中，NTRKl基因的点突变和经典剪接变异可通过PCR-Sanger测序鉴定出来，但PCR-Sanger测序在检测NTRKl基因的大片段缺失时明显不具有优势；针对大片段缺失，首先通过qPCR检测NTRKl基因可能的片段缺失，然后联合应用gap-PCR和Sanger测序,精确确定缺失范围和断裂点；若在患者中只发现单亲来源的NTRKl基因致病变异，qPCR分析结果显示另夕L个亲本及患者不存在NTRKl基因的大片段缺失时，则对患者及其父母进行1号染
4、色体上NTRKl基因附近STR等位基因分型，判断患者是否为突变等位基因的UPDo多项研究结果表明，CIPA患者的NTRKl基因突变中，出现频率最高者为c.851-33TA7-90本研究的19个CIPA家系中有10个家系的先证者携带该变异,该变异在内含子中形成新的剪接受体ag，引起137bp的内含子冗余80家系19CIPA先证者的父母为远亲属，有共同祖先，这样的夫妇生育患有遗传病胎儿的概率较随机婚配的夫妇更高10JO近亲婚配与先天性畸形和常染色体隐性疾病的风险增加有关，据估计，近亲婚配后代中先天性异常的患病率比非近亲婚配人群风险高1.7%2.8%11,这主要归因于常染色体隐性疾病。虽然我国现行婚
5、姻法规定禁止三代以内亲属结婚，但仍然建议有血缘关系的夫妇在生育前进行遗传咨询，以预测生育风险。2. CIPA家系的产前诊断：对于生育过CIPA患者的家庭,通过精准的产前诊断可以有效避免再次生育CIPA患儿。本研究中例9和例12家系中胎儿母亲为NTRKl突变基因的携带者,其余17个家系中胎儿父母均为NTRKl突变基因的携带者，先证者的母亲再次妊娠的20例胎儿的产前诊断结果显示，正常基因型：携带者：患者的比例约为1:2:1,符合常染色体隐性遗传病的孟德尔遗传规律。本研究中,QPA家系的产前诊断是基于先证者致病变异鉴定的基础之上的，针对先证者存在的不同基因变异类型而制订个体化的诊断策略。若先证者存在
6、NTRKI基因的点突变、剪接突变、微缺失或微重复，对胎儿相应变异位点进行PCR-Sanger测序判断胎儿是否携带与先证者相同的变异；若先证者存在NTRKl基因的大片段缺失,对胎儿缺失序列进行g叩PCR检测判断胎儿是否存在与先证者相同的大片段缺失变异；若先证者为NTRKl突变等位基因的UPD,对胎儿进行产前诊断时，首先要检测胎儿是否携带与先证者相同的基因变异以及此变异的杂合性,再通过STR等位基因分型检测胎儿是否为UPDo3. UPD患儿家系产前诊断的特殊性:对于生育过UPDCIPA患者的家系，为了防止双亲由于染色体变异、遗传印记等影响而再次生育UPD患儿，先证者母亲再次妊娠时进行产前诊断是必要
7、的120STR是由27个核昔酸重复单位串联而成的DNA片段，在群体中存在多态性，在亲子之间遵循孟德尔基因分离率,长度会精准地代代遗传。因此，多态性STR等位基因含有丰富的遗传学信息，具有高度遗传特异性13,通过对患者及其父母多态性STR等位基因进行匕戢，可以确定患者是否为父源或母源UPDo此外，高分辨率的二代测序技术的发展也拓宽了UPD检测方法的多样性14,先证者及其父母的高通量二代测序对于UPD的检测及所涉及范围的确定具有重要提示作用。在先证者为UPD的家系中，进行胎儿产前诊断时，首先检测胎儿是否携带与先证者相同的致病变异，若为此变异的杂合子，则胎儿是CIPA变异的携带者，若胎儿与先证者的基因型相同，则胎儿是QPA患者，若不携带此变异则胎儿为正常基因型。本研究在完成QPA患者致病基因型鉴定的基础上联合应用PCR-Sanger测序、qPCR、gap-PCR和STR等位基因分型等单基因遗传病检测方法,建立了完善的CIPA分子诊断和产前诊断复合技术体系，为20例CIPA高风险胎儿提供了精准的产前诊断，对于CIPA疾病的预防和优生具有重要意义。
