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1、2022慢性HBV感染者血清HBVRNA检测及临床应用的专家共识(完整版)摘要自1996年在慢性乙型肝炎患者的外周血中发现游离的乙型肝炎病毒(HBV)RNA以来,越来越多的研究致力于阐明血清HBVRNA的生物学特征和临床应用价值。该共识总结了血清HBVRNA存在形式、定量检测方法及目前临床应用的研究进展，并针对定量检测的靶标区域、检测结果和临床应用作出推荐意见，以期更好地将该指标用于临床慢性HBV感染者的管理。一、背景慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染仍然严重威胁国人健康1。现有的抗HBV药物核苜(酸)类似物nudeos(t)ideanalogues,NAs和聚乙二
2、醇干扰素(pegylated-interferon,PEG-IFN-a)尚不能在短期内治愈慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)存在于肝组织内的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNAlcccDNA)是HBV复制的源头,与慢性持续性感染和CHB难以治愈密切相关。但cccDNA的检测需要有创的肝穿活检，无法广泛开展。探索能够反映肝组织内CCCDNA存在及转录活性的血清替代指标，以客观评价抗病毒疗效及判定合适的停药时机乃当下之亟血清HBVRNA是近年发展起来的HBV病毒学指标，我国慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)2和欧洲肝病学会(Europ
3、eanAssociationfortheStudyoftheLiver,EASL)的乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南(2017年版)3均指出，血清HBVRNA水平可反映肝组织CccDNA转录活性，与患者的病毒学应答及预后相关。2019年EASL和美国肝病学会(AmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases,AASLD)联合发表的HBV治疗终点会议报告中，也提出将血清HBVRNA作为CCCDNA存在和转录活性的测定指标4。近期，我国批准了第一款血清HBVRNA检测试剂，相信随着更多标准化HBVRNA检测试剂的诞生，将会极大地拓展其在临床中的应用。本共识
4、将从血清HBVRNA的生物学特征、定量检测方法和临床应用3个方面进行阐述，并针对检测和临床应用作出推荐意见，以期更好地将该指标用于临床慢性HBV感染者的管理。二、血清HBVRNA的存在形式1. HBV前基因组RNA(pregenomicRNA,pgRNA):1984年,Miller等5首次在CHB患者血清中观察到以HBVDNA-RNA杂合分子形式存在的HBVRNAo1996年，德国学者Kock等6通过CDNA末端快速扩增的方法证实了慢性HBV感染者的血清中存在多聚腺昔酰（poyA）化的HBVRNAo但直到20年后的2016年，才有学者证实血液中HBVRNA的主要来源为未经逆转录的HBVpgRN
5、A,存在于有病毒外包膜包裹或裸的核衣壳内7-12o考虑到可能的潜在感染性,国内学者将前者称为HBVRNA病毒样颗粒12-14o此外，伴随着逆转录过程，P蛋白的RNaseH活性会将作为模板的pgRNA自逆转录起始点逐步降解,并由此产生3,末端不同长度缺失的PgRNA15-16oNAs在抑制负链DNA逆转录合成的同时，会显著增力口3端缺失pgRNA的释放15o2. HBVpgRNA剪接变异体和3端截短型pgRNA:CHB患者血清中的HBVRNA主要来源于包裹在核衣壳内的pgRNA,且除了全长pgRNA及其逆转录残余外9-12,还有不同形式的pgRNA剪接变异体和3端截短体等10,17-19自198
6、9年科学家首次在HBV感染者的肝脏中鉴定出pgRNA剪接变异体以来20,已陆续报道20种可分泌至细胞外的PgRNA剪接变异体（spl-sp20）20-23o其中最主要的剪接变异体类型是剪接供体位点和受体位点分别位于2447nt和489nt的spl,其含量可以达到pgRNA总量的30%21,24-25HBV基因组有位于1919nt的经典加尾信号（UAUAAA）和位于HBX编码区1787nt的非经典加尾信号（CAUAAA）,分别产生3.5kb全长pgRNA和缺失了两个加尾信号之间序列的截短型pgRNA26-27。近期的研究结果表明,随着CHB患者治疗时间的延长和年龄的增长,截短型pgRNA占患者血
7、清总HBVRNA的比例会有所升高27-28。3. HBx转录本：近年来发现，HBx转录本也是血清HBVRNA组分之-,但含量较低19,29。其存在形式主要有3种,分别为5端始于HBx编码区第一个ATG上游的编码全长HBx蛋白的典型转录本、第一个ATG之后的编码截短HBx蛋白的转录本以及包含了P蛋白开放阅读框的超长HBX转录本19。三、血清HBVRNA的定量检测1.血清HBVRNA定量检测技术：目前用于定量检测血清HBVRNA的技术主要为基于TaqMan探针法的逆转录-定量聚合酶链反应(quantitativereversetranscription-polymerasechainreactio
8、n,RT-qPCR)o考虑到HBVRNA水平呈现出从preCCxS到X区的逐渐降低15,30-31,建议将血清HBVRNA检测的靶区域设计在pgRNA5端，并尽量位于spl剪接供体位点2447nt之前。此外，有研究在逆转录的引物上添加一段人工设计的随机锚定序列”并作为定量引物，以排除HBVDNA的干扰12z26实时恒温扩增和检测技术(simultaneousamplificationandtesting,SAT)技术也已被成功用于血清HBVRNA的检测，该技术或有助于进一步规避核酸提取产物中混杂的DNA对HBVRNA定量的干扰32o推荐意见1:血清HBVRNA检测试剂的标靶区域应位于PgRNA
9、的5端，并位于2447nt（spl剪接供体位点）之前。2.血清HBVRNA定量检测的溯源与标准化：中国食品药品检定研究院已经研制出乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家标准品（批号340008-201901）其来源于临床HBVRNA阳性患者的血浆冻干粉，单位为U/ml,适用于HBVRNA定量检测试剂盒的质量评价。同时，也需使用不同试剂盒平行检测来源于不同临床场景（如不同自然分期、治疗史及病毒基因型等）患者的样本，比较HBVRNA定性结果（阴阳性结果）的一致性，比较定量结果的正确度、精密度、抗干扰性、灵敏度、线性范围等关键性能指标，有助于商品化试剂性能的进一步完善。但目前仍缺乏国际公认的标准物质，HBV
10、RNA定量检测的量值溯源和标准化也是目前迫切需要解决的问题之一。3,血清HBVRNA定量结果的解读：表1总结了血清HBVRNA定量检测的不同结果形式，以及对应的解读。表1HBVRNA定量检测不同结果形式及其对应的解读HBVRNA（拷贝/ml或U/ml）解读未检出无扩增信号,未检出HBvRNA最低检测限WHBVRN2O%线性范围低限WHBVRNA线性范圉高限检出HBVRNA,IL位于线性范围内.定量值的精密度可保证.CV线性范围高限HBVRNA浓度高于线性范围高限,如右必要,需稀群后复测和定量无效各种原因引起的结果无效,需重新检测注:CV：变异系数四.血清HBVRNA的临床意义1.血清HBVRN
11、A与肝组织内CCCDNA的相关性：血清HBVRNA主要由肝细胞核内的CccDNA模板转录而来，故可用于反映cccDNA的拷贝数量及其转录活性。研究发现，在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染患者中，其血清HBVRNA定量和肝内CCCDNA定量存在一定相关性（0.2500.781）33-37,不同研究之间相关系数的差异可能与队列患者临床特征以及血清HBVRNA和肝内CCCDNA检测方法的不同有关。但对NAs经治的CHB患者，既往研究则显示血清HBVRNA定量和肝内cccDNA定量之间无明显相关性37-38。然而，恩替卡韦（entecavir,ETV）治疗后患者血清HBVRNA水平与肝内CCCDNA的转
12、录活性（即肝内HBVRNA定量与CCCDNA定量的比值）呈正相关（0.584,=0.001）38,提示NAs治疗后血清HBVRNA定量可能反映的是肝内CCCDNA的转录活性而非定量水平。此外，有研究巧妙地以拉米夫定耐药（Iamivudineresistance,LAMR）突变位点（rtM204IV）作为区分原有的和新合成cccDNA以及血清HBVRNA的特征性标志物，发现LAMR患者的血清HBVRNA与肝内cccDNA的LAMR突变比例高度相关（0.96,P=0.0001）,从质的角度阐明NAs治疗后血清HBVRNA水平与肝内cccDNA的相关性39o对于PEG-IFN-C（治疗的患者，尽管近
13、期一项小样本量研究报道，血清HBVRNA定量在治疗前后均与肝内CCCDNA定量呈中度相关（0.781、0.728zP0.001）33但由于IFN对cccDNA和HBVRNA存在直接或间接的降解作用40-43,PEG-IFN-C(治疗下血清HBVRNA可否准确反映cccDNA的水平及其转录活性仍需进一步明确。综上所述，对于未经抗病毒治疗或经NAS治疗的慢性HBV感染患者，血清HBVRNA有望作为反映肝内CCCDNA定量或转录活性的标志物。推荐意见2:血清HBVRNA是反映肝内cccDNA数量和遗传组成及其转录活性的无创性标志物，但应注意抗病毒治疗对血清HBVRNA与肝内CCCDNA定量水平相关性
14、的影响。2.血清HBVRNA与其他病毒学指标的相关性：在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者中,血清HBVRNA水平与血清HBVDNAsHBsAg和HBV核心相关抗原(hepatitisBcore-relatedantigenzHBcrAg)定量均呈正相关9,33-35,44-46,且在HBeAg阳性CHB患者中更为明显9z33,44-45;而在启用NAs抗病毒治疗后，患者血清HBVRNAHBVDNA和HBsAg之间的相关性会逐渐下降甚至消失33,45,但与HBcrAg始终保持着较好的相关性33,45-46;此外，对于接受PEG-IFNy治疗的患者，血清HBVRNA与HBVDNA和HBcrAg在治
15、疗前后均具有良好相关性33,45-48,但治疗后与HBsAg的相关性明显减弱，甚至失去相关性33,38,45,48。推荐意见3:血清HBVRNA水平与其他血清病毒学定量检测指标的相关性应考虑抗病毒治疗状态的影响。经NAs抗病毒治疗后，血清HBVRNA与血清HBVDNA和HBsAg的相关性均下降甚至消失；但其与HBcrAg在治疗前后皆存在较好的相关性。3 .血清HBVRNA在区分HBV感染自然史中的价值：慢性HBV感染自然史可分为免疫耐受、免疫清除、免疫控制和再活动4期2-3。但因缺少患者的肝脏组织学结果，临床上依据无创性指标对患者的分期会有部分患者被归为灰色阶段，仍需无创性指标进行完善。早期曾有研究结果显示血清HBVRNA水平在自然病程分期中的分布规律与血清HBVDNA水平类似34,且可用于预测CHB患者的自然史分期49。近期中国香港和北美学者的横断面研究结果均显示，与以往传统的病毒标志物相比，血清HBVRNA在区分慢性HBV感染者的自然病程方面未凸显出应用优势44-45o未来仍需在大样本量且有肝组织学结果的慢性HBV感染人群中进一步探究。4 .血清HBVRNA预测患者治疗应答的价值(1)血清HBVRNA预测NAs治疗应答：越来越多的证据表明，血清HBVRNA可用于预测CHB患者接受NAs
