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1、2022年XG病毒检测技术研究进展(全文)摘要尽管自然感染或疫苗接种已经初步建立了群体保护屏障，但随着多种新冠病毒变异体的持续出现，突破性感染仍然无法完全避免，新冠病毒检测仍是发现传染源和中断传播链的关键。目前，以核酸、抗原、抗体检测为基础的新冠病毒检测形式呈多元化发展。在相对疫情早期的后新冠时代，复工复产和疫情防控常态化，需要我们根据不同场景的防控需求选择合适的检测手段。本文总结了现有新冠病毒检测技术的原理及其适用特征，以期为临床及公共卫生人员提供精准化决策依据。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2,简称新冠病毒)是21世纪继严重急性呼吸综合彳IEsevereacuteresp
2、iratorysyndrome,SARS)和中东呼吸综合征(MiddleEastrespiratorysyndrome,MERS)后引发重大公共卫生事件的第三个B属冠状病毒。作为正链RNA病毒，其基因组可编码16种参与RNA转录和复制的非结构蛋白以及包括刺突;spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白、核衣壳(nucleotide,N)蛋白在内的4种主要结构蛋白。2019年末，武汉突发不明原因肺炎，通过病毒分离培养和核酸鉴定技术首次明确了新冠病毒。疫情早期，随着新冠病毒扩散、新冠肺炎病例激增，以核酸为靶标的实时荧光定量聚合酶链反应(real-time
3、polymerasechainreaction,RT-PCR)精准诊断技术对检出阳性个体、阻断传播链、制定防控措施起到了关键作用。在相对疫情早期的后新冠时代，自然感染或疫苗接种逐步建立了抵抗病毒入侵的免疫防线，相当一部分传染源归因于无症状感染，对大规模疑似患者及密切接触群体的快速筛查成为关注重点。在此背景下,基于核酸、抗原和抗体检测的新冠病毒诊断技术多元化，基于成簇规则间隔短回文重复序歹!J(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)和生物传感器原理等新兴探测手段得到开发应用。本文就已报道新冠病毒检测技术的原理及其适
4、用特征进行综述，以期帮助读者了解并合理选择诊断方式。一、病毒分离培养病毒分离培养可用于识别和扩增具备复制能力的活体病毒，长期以来都被视为实验室诊断病毒感染的金标准。临床样本来源的病毒悬液接种于实验动物或病毒嗜性细胞可实现分离毒株的纯化和扩增培养，用于后续鉴定分型和病原学表征。新冠病毒的分离培养必须在生物安全三级实验室进行，鉴于血管紧张素转换酶2(angiotensinconvertingenzyme2,ACE2)受体是新冠病毒侵入宿主细胞1的关键，现用于培养新冠病毒的主要细胞系为表达丰富ACE2受体的Vero或VeroE6猴肾细胞2,同时采用终点滴定法或噬菌斑法，可量化病毒感染滴度。终点滴定法
5、3通过观察感染细胞的细胞病变效应来判定50%组织培养感染剂量(TCID50);噬菌斑法4则是计数病毒感染的单个细胞所形成单个噬菌斑，即噬菌斑形成单位(PFU)数量。虽然目前高敏感度和特异度的分子检测技术已成为病毒病原学诊断的主流方法，但出于鉴定和研究新兴病原体(如新冠病毒)的目的，病毒分离培养技术的地位仍不可替代，主要体现在5,6,7:(1)作为核酸及血清学检测方式性能评估的参考；(2)3蓟正预防、治疗类药物制剂及中和抗体的抗病毒效果；(3)为致病机制研究、流行病学调查和灭活病毒疫苗研发提供毒种资源；(4)明确样本是否具备传染性。然而，新冠病毒的分离培养时长可达46d8,安全防护要求高，无法成
6、为疫情形势下尽早筛查疑似患者的常规手段。二、病毒核酸检测(一)全基因组测序基于下一代测序原理的宏基因组(Metagenomicnext-generationsequencing,mNGS)技术是目前临床最常用的高通量和实现全基因组测序的病原学诊断方法，可对样本来源的所有DNA或RNA核酸分子进行测序，无需靶标富集和扩增，即可实现样本中细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物基因组的并行表征，具有无偏泛病原体检测的特性9o新冠病毒的检测由基于RNA的mNGS程序执行10,疫情伊始，借助mNGS技术，中国科学家在5d内即明确了不明原因肺炎的致病原为一种Sarbe亚属的新型B属冠状病毒11,进化分析结果显示
7、,其基因组序列与蝙蝠来源毒株最为接近、与SARS冠状病毒同源性高达79%另外，Mostafa等12报道，在mNGS鉴定为阳性的40份鼻咽拭子样本中，RT-PCR仅能检出77.5%(31/40),同时，还发现患者上呼吸道微生物多样性差异与疾病严重程度显著相关。因此，mNGS不仅是追踪病毒进化谱系、表征变异株基因序列和亚单位疫苗研发基础手段，还是精准评价新冠肺炎患者呼吸系统微生态特征性变化的有效工具。然而,该技术的整体工作流程尚无统一标准其程序的复杂性决定了检测周期至少耗时24H13,平均约48h甚或更长，对于新冠肺炎患者的早诊断并不占据优势。(二)基于PCR的核酸检测基于对病毒遗传物质核酸序列的
8、扩增，RT-PCR可从混合物中检测到极少量的病毒存在，是新冠肺炎的首选诊断方法和确诊金标准。该技术包括逆转录步骤和聚合酶链式反应14,逆转录产物扩增的同时伴随着荧光信号的产生，由此形成可量化反应系统被热循环仪捕获。荧光值达到界定阈值时的循环数被称为阈值循环15(Cyclethreshold,U),是判断核酸检测结果的重要参数，Ct值越低，代表样本中病毒负荷越高。世界卫生组织(WHO)于2020年中公布了多国权威机构针对N、E、RdRP和ORF基因设计的引物和探针靶向序列JWSJung等16的研究表明，这些引物-探针组合对新冠病毒均具有高度特异性且未观察到与其他呼吸道病毒存在交叉反应。目前，我国
9、推荐将N基因和ORFlab基因并行作为新冠病毒核酸检测的靶标17,同一样本满足双靶标阳性或单靶标重复检测阳性则可判定为阳性结果。相对来说，S基因序列在已报道的变体中属于突变高发区18,虽不适于作为新冠病毒变体诊断的通用靶标，但对于突变位点的鉴定和各类变体的识别却大有裨益。Xiong等通过数据库比对分析鉴定出Alpha和Delta病毒株S基因的特征性突变C1709A,由此设计了靶向引物使得RT-PCR可用于以上两种变体的特异性诊断191值得一提的是,数字PCR（DropletdigitalldPCR）是以有限稀释为基础、以泊松分布为原理、以绝对定量为核心的第三代PCR技术20O其不受反应效率和引
10、物特异性影响，无需外部对照即可获得绝对定量。在相同实验条件下，dPCR对新冠病毒ORFIab和N基因的检出极限分别为2.1和1.8个拷贝/ml而RTqPCR分别为1039和873.2个拷贝m21o相关临床研究表明22,23,尽管dPCR的拷贝数与RT-PCR的Ct值高度相关，但前者报告的假阴性结果更少，对于低病毒载量样本的检测是更为灵敏和准确的工具。我国2019新型冠状病毒核酸检测专家共识儿24提及，当核酸检测Ct值介于灰度区时，可采用敏感度更高的dPCR方法进一步确定。但鉴于高成本和低通量的局限性，dPCR并未在临床病原学诊断中普及。（三）基于等潮T增的核酸检测相较于PCR技术，等温扩增核酸
11、检测简化了热循环反应过程，缩短了检测周期。以环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)25为例，该方法利用46个引物识别目标序列的不同区域,在恒定温度(60-65)下通过茎环结构进行反复扩增，1h合成的目标基因多达109拷贝。用于新冠病毒的核酸检测的LAMP技术增加了逆转录步骤，在此基础上，将副产物焦磷酸镁引起的浊度变化放大26,则可通过浊度计判断扩增结果，同一研究还证实，LAMP与RT-PCR具有相似的敏感度。其他研究27,28也表示，LAMP方法用于新冠样本检测可达到90%100%的敏感度和95%99%的特异度，同时多靶标还提高了扩
12、增的准确性检测时间却仅需30min。此外新冠病毒变体AIPha、BetaxGammasDelta和Omicron在N基因12-213碱基序列区高度保守，Luo等据此优化了引物设计29,使得LAMP技术对新兴变体的诊断具有兼容性。其余等温扩增核酸检测方法还包括重组聚合酶扩增、滚环扩增和基于核酸序列扩增30,但在新冠病毒诊断方面的应用相对少见。综上，等温扩增技术具备高特异度、高敏感度、高效率、设备简化的优点，但其多引物、多酶的反应体系需求同时也加大了检测设计和研发的复杂程度，我国药监局批准的新冠病毒核酸检测试剂盒中仅有两款采用了等温扩增技术。(四)基于CRISPR的核酸检测CRISPR的原理为向导
13、RNA(guideRNA,gRNA)弓I导下实现的Cas蛋白酶核酸剪切功能。具体来说，根据新冠病毒的RNA序列可设计特异性靶向gRNA,理论上，只要样本中存在病毒靶向序列，gRNA就能对其进行精准识别并激活Cas蛋白酶执行报告核酸分子切割功能，使得信号分子得以释放、捕获。张锋团队利用CRISPR-Cas13a系统开发的SHERLOCK技术31是该领域的典型代表，结合重组聚合酶等温扩增技术在术前患者筛查中平均检测耗时约70min检出下限为42拷贝/ml,荧光读数的特异度和敏感度均达100%,侧流读数分别达100%和97%32;为简化流程，该团队还采用了LAMP法将RNA扩增和Cas酶切割步骤合二
14、为一,不到1h即完成了核酸检测，检测限为RT-PCR的三十分之一（33拷贝/ml和1000拷贝/ml）330在此基础上,dePuig等设计了靶向新冠病毒变体突变序列的gRNA,拓展了该技术在即时鉴定N501YsE484K等变体相关突变位点方面的应用34另外,Broughton及其同事报道了第一个基于CRISPR-Cas12系统的DETECTR技术35,实现了45min内对新冠病毒的定性检测。Liang等利用该技术开发了新冠病毒S基因分型的多重检测，实现了AlPha、Beta、Delta变体的快速鉴别360CRISPR的酶反应特质和gRNA选择赋予了该技术高敏感度、高特异度和灵活靶向性的优势，但
15、其优良效能应用于临床诊断的普适性仍有待证实。三、病毒抗原检测核酸检测和抗原检测都是直接靶向新冠病毒的检测方式，前者用于检测感染早期阶段活跃复制的病毒，而后者则利用特异性抗体对病毒特定蛋白进行鉴定。N蛋白在进化上高度保守,是新冠病毒抗原检测的主要靶标370现今报道的抗原检测多基于侧流免疫反应（Lateralflowimmunoassay,LFIA）原理，这是现场即时检测（Point-of-caretests,POCT）的最主流形式，15min左右即可获得结果38o该技术通过毛细流驱动样本液滴流过层析条（图1）,样本中的待测分子（特定抗原）会先与结合区中的一部分标记分子联结，检测条带（T）区可捕获
16、待测分子-标记分子联结体并与其反应转换为颜色信号，以定性检测特定抗原；而质控条带（C）区可与未联结的标记分子反应,以反映同一检测的质控水平39L我国于2022年3月上市的第一批新冠病毒抗原自测试剂盒均以LFIA原理为基础，不同之处在于其采用的标记分子和信号读取设备不一，可选择胶体金、乳胶微粒或荧光分子。快速抗原检测的敏感度与病毒载量相关，在无症状感染者中证据仍然有限40o研究发现41,在U值低于25的样本中，敏感度为97%100%;在Ct值介于25-30的样本中，敏感度为50%81%;而在Ct值高于30的样本中，敏感度低至12%18%.相应的,WHO关于新冠病毒快速抗原检测的文件42指出，快速抗原检测的结果在存在社区传播的地域最为可靠。因此,抗原检测无法替代核酸检测成为确诊标准，然而，对于不具备核酸检测能力的基层卫生机构、感染风险相对
