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1、自噬基因BeCIin-1在胃癌及癌前病变中表达及其与HP感染相关性研究刘慈敏邵华明亮姚壮凯孙岩潘君利(连云港市第二人民医院甲乳外科，江苏连云港222000)第一作者简介：刘慧敏(1985-)男，硕士,主要从事甲状腺、乳腺疾病基础及临床研究。通讯作者：潘君利，从事肿瘤外科护理工作摘要：目的：探讨BCClinT在胃癌及癌前病变中的基因表达以及对幽门螺杆菌(HP)感染的影响。方法：采用荧光原位杂交技术检测65例胃癌,46例不典型增生,60例慢性萎缩性胃炎和58例慢性浅表性胃炎组织中自噬基因BCClinT的阳性扩增情况，并采用快速尿素酶法,HE染色法检测HP感染情况。结果：BCCIin-1基因在CSG
2、,CAG,AH,GCa中阳性扩增率依次下降，分别为81.7%,74.1%,45.7%,43.1%;HP感染在癌前病变组织及胃癌组织中阳性率依次为21.7%,55.2%,67.3%,64.6%,胃痛及不典型增生组织中HP阳性患者BCClin-I扩增阳性率明显低于HP阴性患者(P0.05),HP感染阳性胃癌组织中bcclin-1的基因表达与胃癌组织分化程度及浸润深度相关，与性别、年龄、淋巴结情况无关。结论：在胃黏膜癌变过程中，HP感染可能影响自噬基因的表达下调或缺失，抑制细胞凋亡和分化发挥致癌作用。关键词胃癌；自噬;HP：Beclin-1；荧光原位杂交技术(FISH)Correlationbetw
3、eenHpinfectionandexpressionofBeclin-IingastriccancerandprecancerouslesionAbstractObjective:TostudytherelationshipbetweentheexpressionofBeclin-Iandhelicobacterpylori(Hp)infectioninCarcinogennesisofgastricmucosaandprecancerouslesion.Methods:TheexpressionofBeclin-Idetectedin65casesofgastriccarcinoma(GC
4、),46casesofatypicalHyperplasia(AH),60casesofchronicatrophicgastris(CAG),58casesofchronicSurperficialgastris(CSG)byfluorescenceinsituhybridization(FISH)technologyincarcinogenesisofgastricmucosaandprecancerouslesionandHpwasassessedbyusingrapidureasestainingtestcombinedwithHEstainingts：Theinfectionrate
5、sofHpwasincreasedinCSG,CAG,AHandGCby21.7%,55.2%,67.3%,64.6%.correspondingtothepositiveratesofBeclin-Iexpressiondepreasedby81.7%,74.1%,45.7%,43.1%,ThepositiveratesofBeclin-IexpressioninAHandGCwerelowerthanthatnon-infectedbyHprespectively(P0.05),Furthermore,theexpressionofBeclin-IgeneinGCwithHpinfecti
6、onwascloselycorrelatedwithtissuedifferentiationandinvasionstage,andtherewasnorelationshipwithsex,ageandlymphnodeusion：Hpinfectioncandown-regulatetheexpressionofBeclin-Igeneduringthecourseofgastriccancerprogressionandinhibitcellapoptosisanddifferentiationincarcinogenesis.Keywordsgastriccancer;autopha
7、gy;HP;Beclin-I;Fluorescenceinsituhybridization(FISH)幽门螺旋杆菌感染在胃粘膜癌变胃痛过程中起着始发或触动因素，引起细胞增殖和凋亡的失衡促进胃癌发生。BeCIinT是参与自噬调控的重要基因，可以提高细胞自噬能力抑制肿瘤的生长，是候选的肿瘤抑制基因。本研究通过检测胃癌变过程中HP感染情况并采用FISH方法检测胃痛及癌前病变组织中自噬基因BCCIinT的表达，探讨自噬活性改变及HP感染致胃粘膜癌变的可能机制。1、资料与方法一般资料所有标本为2014年9月至2019年12月我院胃镜活检标本及外科手术切除的组织，均经病理检查证实，其中男性135例，女性
8、94例，年龄2281岁，平均(51.29.6)岁，慢性浅表性胃炎58例，慢性萎缩性胃炎60例，中-重度不典型增生46例，胃癌65例，胃癌组织中高分化腺癌41例，中低分化癌(包括印戒细胞癌)24例；未浸及浆膜43例，浸及浆膜22例；有淋巴结转移39例，无淋巴结转移26例；胃癌患者术前均未行放化疗。1.2方法1.1 .1HP的诊断采用快速尿素酶法、W-S银染法检测HP的感染情况,两者均为阳性(定为Hp+),两者均为阴性(定为即-)，一阴一阳不纳入研究对象。1.2.2荧光原位杂交技术(FTSlI)检测beclinT的mRNA表达水平标本组织经固化后按照BaSPinarS等方法设计BeCIinT的CD
9、NA引物序列及Taqman探针，PCR引物序列为：5-Cttaccacagcccaggcgaaac-3,5-GCCAGAGCATGGAGCAGCAA-3，TaqnIan探针序列为：5FAMYACTGTGCCAGATGTGGAAGGTTTAMRA3。组织切片经5过夜烘烤,二甲苯室温脱始2次,每次IOnlin,随后浸入100%乙醇中5min,复水后50下30%酸性亚硫酸钠处理2030min,氯化钠、柠檬酸钠水溶液(2XSSC)漂洗2次，每次5min,浸泡在蛋白酶K工作液中37C下孵育78min,2XSSC溶液漂洗后依次经-20C预冷的70%、85%、100%乙静各2min脱水，丙酮浸泡2min,干
10、燥，加盖玻片至56C3min；将玻片在变性液中浸泡5min,预冷的70%、85%、100%乙醇中各3min梯度脱水，4550C预热25min后与探针在42C保温箱中过夜杂交；玻片用甲酰胺洗涤，暗处自然干燥后经二眯基苯基呵躲荧光染料(DAPI)复染，封片,暗处放置20IDin后荧光显微镜下观察玻片。判定方法：计数标准参照VigenRA等方法判定：计数30个细胞，统计RaliO值(RaIiO值二30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。RatiO2.2为阳性结果，提示样本中基因发生扩增(Ratio在2.3-4.0提示低水平扩增，4.1TO提示中水平扩增，10提示高水平扩增)；Rati。
11、在L8-2.2之间时,选择增加计数细胞至100个，或重做FISH试验来判断最后结果。1 .3统计学方法本实验资料采用SPSSI9.O软件进行数据分析，计数资料采用2检验，beclinT基因扩增与临床病理指标之间关系采用I检验分析,P0.05表示差别有统计学意义。2 .结果2.1beclin-l基因胃癌组织中BeClinT基因扩增阳性率43.1%,癌前病变组织CSG及CAG、AH中BeCIin-I基因扩增阳性率依次为81.7%、74.1%,45.7%,癌组织中beclinT基因扩增水平与癌前病变组织比较显著下调(PR.016),见表L2.2HP感染在各种胃粘膜病变中对BeCIinT基因扩增的影响
12、不同组织类型中HP检出率以AH中最高，其次为CAG及GCa,它们与CSG相比差异具有统计学意义(P0.05).BeCIinT在癌前病变组织中表达程度较强，随着胃癌的形成中病变恶性程度的加重而明显下降(见图1,图2),AH及GCa组扩增阳性率明显低于CAG、CSG组(P0.05),AH及GCa组中HP阳性患者BCClinT扩增阳性率明显低于HP阴性患者(P0.05),见表2。2.3HP感染阳性胃癌BcCIin-1扩增阳性率与临床病理特征的关系HP感染阳性胃癌患者组织中BeCIin-1扩增阳性率与组织分化程度及浸润程度相关，低分化胃癌BeCIinT基因扩增阳性率明显低于中高分化胃癌(P0.01),
13、随着胃癌浸润程度加深，BeCIinT基因扩增阳性率渐呈下降趋势，而与患者性别、年龄、淋巴结情况无关.见表3。表1：BCCIin-1及HP在各种胃粘膜病变中的关系nHP感染Beclin-I阳性阴性阳性率类型PH-I性阴性阳性率CSG60134721.7%491181.7%CAG58322655.2%431574.1%AH46311567.3%212545.7%GCa65422364.6%283743.1%表2：不同胃粘膜病变组织中HP感染对BeClin-1基因扩增的影响组别HP例数Beclin-I?值P值-+CSG13850.32470.9564-47344CAG3211210.53710.64
14、89-26422AH3120117.16660.0156-15510GCa+4225175.34200.0113-231211表3：HP感染阳性胃癌患者BeClinT阳性扩增与临床病理特征的关系组别例数HP感染Beclin-I值P值+年龄60岁37261790.12580.7116260岁2816106性别男35251962.65240.3031女301789分化程度中高分化413019114.53690.0017低分化241284浸润程度未及浆膜层433222108.01370.0069浆膜层外221055淋巴结转移有39241680.22570.6312无2618117图I胃癌前病变组织(慢性萎缩性胃炎)中BCCIinT荧光检测结果图2胃癌中BCClinT荧光检测结果3讨论胃癌的发生是多步骤逐渐演变的过程，持续HP感染导致“慢性胃炎-胃黏膜萎缩-肠上皮化生-异型增生-胃癌”被认为是胃癌的发病模式，HP感染可能引起胃上皮细胞的增殖与凋亡，因此研究HP感染在胃癌及癌前病变中的致病作用受到广泛重视，HossainMA等研究发现早期胃癌HP感染率明显高于进展期胃癌，本研究发现HP在CSG,CAG,AH,GCa中阳性率分别为21.7%,55.2%,67.3%,64.6%,以AH中阳性率
