聚合酶链反应及其应用.ppt

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1、52341678PCR的原理与反应条件PCR的DNA聚合酶与扩增的精确性PCR的模板及制备PCR的引物设计及合成PCR反应的其它控制参数PCR技术的衍生与发展PCR技术在生命科学研究中的应用PCR技术在临床医学方面的应用聚合酶链反应及其应用PCR技术的诞生与发展1 PCR的原理与反应条件PCR技术的反应条件PCR技术的基本原理PCR反应的质量指标PCR技术的诞生与发展 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary mullis发明了具有划

2、时代意义的PCR技术；1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖；1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。PCR技术的基本原理55待扩增DNA区域5变性加热55引物退火55底物聚合5555加热变性555555555555555555退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123555PCR技术的反应条件DNA或RNA模板55待扩增DNA区域594 5 min5555退火55聚合55555循环25-30次目标DNA片段达106-107变性70DNA引物DNA

3、聚合酶dNTPsMg2+（缓冲液）PCR反应的质量指标 PCR反应的质量标准有：特异性（序列选择）有效性（序列产量）上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须准确性（序列对错）对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。PCR扩增反应的精确性2 PCR的DNA聚合酶与扩增的精确性用于PCR的DNA聚合酶简介DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响DNA聚合酶的使用PCR扩增反应的精确性 利用PCR技术扩增DNA靶序列的一个重要问题是这种DNA体外聚合反应的序列忠实程度，即DNA扩增产物序列的准确率。

4、PCR反应的准确率远远低于细胞内的DNA聚合反应，除了缺少完善的DNA聚合校正系统外，影响PCR反应准确率的因素还包括：DNA聚合酶的保真性能（主要因素）DNA链的物理损伤PCR反应体系的洁净度DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响 DNA聚合酶的保真性主要取决于其35的核酸外切酶活性，它负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 106-2.1 X 104范围内。DNA聚合酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：与dNTP的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性 35的核酸外切活性的强弱用于

5、PCR的DNA聚合酶简介 Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4-4），因为它没有35的的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶的聚合出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的普遍则Taq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性避免稀释保存Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性 Taq DNA酶在使用时应注意：用于PCR的DNA聚合酶简介 KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Ta

6、q DNA聚合酶，因而没有5的核酸外切酶活性；KlenTaq DNA聚合酶的Mg2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）在最佳反应条件下，KlenTaq DNA聚合酶出错率为 5.1 X 105，性能略优于Taq DNA聚合酶。反应条件；用于PCR的DNA聚合酶简介 Tth DNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效地反转录长度在1000碱基以下的RNA；Tth DNA聚合酶在Mg2+的存在下，能由DNA模板合成DNA；Tth DNA聚合酶（Thermus thermophilus）好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题。Tth DN

7、A聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很 用于PCR的DNA聚合酶简介 Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，出错率极低；Pfu DNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端；Pfu DNA聚合酶扩增速度极快，达1.5-2 min/kb；Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus）Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。7.0 X 107-1.6 X 106用于PCR的DNA聚合酶简介 Vent DNA聚合酶具有35的核酸外切酶活性和校正功能，因此与其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，具有相对较好的高保真性，其出错率为2.4 X 105-5.7 X 105；Vent DNA聚合酶（

8、Thermococcus litoralis）度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；如果扩增长度大于2 kb，则需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长 如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA聚合酶不能延伸引物。用于PCR的DNA聚合酶简介 DeepVent DNA聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和DMSO等；DeepVent DNA聚合酶能产生长达14 kb的扩增产物，其外切酶DeepVent DNA聚合酶（Pyrococcus species GB-D）活性比Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活

9、性比Taq DNA酶高5-15倍，度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；如果扩增长度大于2 kb，则需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长 如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA聚合酶不能延伸引物。出错率比Vent DNA聚合酶低 2 倍；用于PCR的DNA聚合酶简介 UlTma是一种高保真的DNA聚合酶，可以较高的产量扩增小于3 kb的DNA靶序列，产物呈平头末端。UITma DNA聚合酶（Thermotoga maritima）DNA聚合酶的使用DNA聚合酶的标准使用范围：1-5 Units/mL特异性的改进：在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度

10、。聚合酶的浓度是决定PCR反应成本的的重要参数，浓度 过高不仅能降特异性，同时也导致不必要的消耗。准确性的改进：建议使用高保真的DNA聚合酶 PCR模板制备与纯化3 PCR的模板与制备PCR模板的使用粗样品中的PCR抑制剂PCR模板制备与纯化 DNA和RNA均可作为PCR扩增反应的模板，但一般情况下，mRNA先逆转录成cDNA再进行扩增。PCR模板的来源主要有两大类：纯净物 如重组质粒、制备的染色体DNA、回收的DNA片段粗样品 如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷 嚏液、痰液等 上述粗样品含有大量的PCR反应抑制物质，因此如何去除这些种

11、类繁多的抑制剂或者添加必要的PCR反应增强剂显得十分重要。PCR模板制备与纯化 从各种粗样品中去除PCR反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的手段包括：样品稀释溶剂萃取（氯仿异戊基乙醇 491）乙醇沉淀高速离心超滤粗样品中的PCR抑制剂粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度50mg/mL）血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、heparin（抗凝剂）土壤 腐殖物质、含铁化合物植物 硫酸右旋糖苷 食品 未鉴定的抑制剂痰液 未鉴定的抑制剂PCR模板的使用PCR模板的标准使用范围：102-105 拷贝 特异性的改进：增加模板DNA的量、降低引物与模板的分子比 有效性的改进：增加引物与模板的分子比 模板浓度的变化很大程度

12、上取决于待扩增的碱基序列，但一般而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大，因此对于大分子量的模板DNA（尤其是真核生物基因组DNA），在扩增之前最好先用超声波处理或限制性酶消化。PCR引物的设计原则4 PCR的引物设计及合成PCR引物的使用引物的在线设计工具及免费软件简介PCR引物的设计原则 选择合适的引物是PCR实验设计的重要步骤，合适引物最基本的引物的长度标准就是与靶序列的高特异性杂交。为达到此目的，引物设计应注意下列几点：理想的引物长度应该在18-30个碱基之间，常见的是20-27个碱基PCR引物的设计原则引物的GC含量 引物序列中的GC含量应在35%-65%之间，最好在45%-5

13、5%范围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高的GC碱基，那么就在其5端设计一串A或T；同样，如果引物中的AT含量过高，就在其 5 端设计一串G或C，以便将整条引物的GC含量控制在合适的范围内。PCR引物的设计原则退火温度（Ta）引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5左右，在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-6，尚不至于影响RCR扩增反应的产量，但它们的退火温度应在55-75范围 引物碱基20，Ta=4 X（G+C）+2 X（A+T）-5（）内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长较低Ta值的引物的3端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或5端。引物的

14、Ta值估算有多种公式，最好根据RCR试剂盒建议的计算方法，例如Alkami Quick Guide试剂盒建议的计算方法如下：引物碱基20，Ta=62.5+0.41 X（GC%）-500/长度-5（）PCR引物的设计原则杜绝互补区域的存在 引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。为扩增后操作提供便利条件 在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的5端引入诸如限限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩增后操作。PCR引物的设计原则引物与模板的互补程度 在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%互补，但检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域 为了减少PCR扩增产物的

15、污染本底，在设计引物序列时应检查模板DNA上是否存在潜在的引物同源区域。尽可能高的互补程度是必要的。PCR引物的设计原则选择内含子序列作为引物序列 在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含引物的末端序列 在引物的两端设置1-2个嘌呤碱基，最好在引物的3端避免G或C 这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。引物3端子序列也是随机多样性的。至少应有1-2个碱基必须是特异性的。引物的在线设计工具及免费软件简介The Primer Generator（TPG）http:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi TPG是一种基于

16、CGI数据库便利的用于定点突变的引物设计工具。只要在网页上相应的位置中键入不超过15个碱基的短核苷酸序列、所期望的氨基酸序列、以及允许替换的最大碱基数，设计工具便会提供满足初始要求的所有可能的引物序列，还能显示酶切位点的消失或增加。但TPG的一个明显缺陷是不能计算引物的Tm值并判断其稳定性。引物的在线设计工具及免费软件简介Primers!http:/ WWW GeneFisher http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web Primershttp:/alces.med.umn.edu/webprimers.html Project DOPE2http:/dope.interactiva.de/NetPrimer http:/ Oligos-U-Like Primers3 http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi PCR引物的使用PCR引物的标准使用范围：0.1-1.0 mM，最好0.2-0.5 mM 特异性的改进：降低引物和dNTP的浓度可以在很大程度上改有效性的改进：增加