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1、致泻性大肠杆菌检验技术致泻性大肠杆菌检验技术概概 念念 大肠杆菌的部分血清型可引起肠道感染，称为致泻性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌（EPEC）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）肠产毒性大肠杆菌（ETEC）肠出血性大肠杆菌（EHEC）肠聚集性粘附大肠杆菌（EAggEC）生物学性状生物学性状 大肠杆菌是革兰氏阴性短杆菌，大小为1.01.5培养特性培养特性 大肠杆菌在普通营养琼脂上生长良好，最适生长温度为37，42 44 仍能生长。兼性厌氧菌，氧气充足生长较好。最适生长pH为6.8 8.0，低于6.0或高于8.0生长缓慢。在普通培养基上的菌落形态在普通培养基上的菌落形态 光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润
2、、光滑，呈灰色，在生理盐水中容易分散。粗造型：菌落扁平，边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。粘液型：常为含有荚膜的菌株。生化特征生化特征-1 分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖等多种糖类，产酸产气。在肠道鉴别培养基上形成有色菌落。吲哚试验、甲基红试验阳性；V-P试验阴性；不能利用柠檬酸盐作为碳源；分解葡萄糖铵盐；不分解尿素；明胶液化阴性；不分解侧金盏花醇；在氯化钾培养基上不生长。生化特征生化特征-2 EIEC：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除O124外无动力；乳糖、蔗糖不产酸或产酸，葡萄糖产酸产气或不产气，H2S阴性，靛基质阳性，酒石酸盐阴性，赖氨酸脱羧酶阴性。O157：H7大肠杆菌
3、不发酵山梨醇或迟缓发酵，在CT-SMAC平板上菌落为白色；绝大多数不具有葡萄糖醛酸酶，不能水解4-甲基伞形花内酯-D葡萄糖酸苷，不能产生荧光；绝大多数EHEC发酵棉子糖、卫矛醇，能够利用鸟氨酸赖氨酸，其他大肠杆菌中20%左右发酵棉子糖，50%左右发酵卫矛醇，有部分大肠杆菌不能利用鸟氨酸赖氨酸。抗原结构抗原结构 大肠杆菌的表面抗原包括菌体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、荚膜抗原（K抗原）O抗原即细胞壁外膜上的脂多糖（LPS），目前已发现O抗原有170多个血清型，H抗原有55种左右。最初分离的菌株动力往往较差，与H抗血清的反映凝集差，需在半固体培养基上传代以利于鞭毛的生长。致病物质与所致疾病致
4、病物质与所致疾病 在肠道内一般不致病，但如果移位侵入肠道外的组织或器官可引起肠外感染，以化脓性炎症最为多见。引起泌尿系统感染的大肠杆菌称为泌尿道致病性大肠杆菌（UPEC），引起尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。一些大肠杆菌还引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、手术创口感染等。在婴幼儿、老年人或免疫力极低的病人中可引起败血症。ETEC是第三世界国家细菌性腹泻和旅游者腹泻的主要病原之一 ETEC分泌耐热肠毒素（ST）、不耐热肠毒素（LT），具有与致病性相关的菌毛等。ETEC通过菌毛粘附在小肠上皮细胞，释放毒素ST和LT，刺激腺苷环化酶或鸟苷环化酶的生产，引起肠液分泌和聚积，产生水样腹泻。EIEC的毒力因子和致病机
5、制志贺氏菌基本一致，临床症状与细菌性痢疾不易区分，主要是发烧、腹部剧烈疼痛与不适、毒血症、水样腹泻，粪便中有少量粘液和血。EIEC通常侵犯大肠，使大肠上皮细胞刷状缘发生局部破坏，细菌被摄入细胞内，侵犯并破坏细胞基底膜，在细胞内扩散、繁殖，并在细胞间扩散，引起细胞的死亡，造成炎症和溃疡。EIEC的侵袭力由120140MD的大质粒编码，与编码志贺氏菌侵袭力的大质粒高度同源，丢失了质粒的菌株也随之丧失。EPEC是婴幼儿腹泻的主要病原菌，主要临床症状是发烧、呕吐、腹泻，粪便中含有大量粘液而无血，症状可持续两周以上，多引起社区的小型暴发。主要毒力因子包括5070KD大质粒编码的束状菌毛介导的粘附作用、噬
6、菌体编码的志贺毒素及LEE毒力岛介导的A/E损伤。EHEC是指能引起出血性肠炎的一群大肠杆菌，包括、026:H11、0111:H8、O125：NM、O122:H19等血清型的部分菌株。目前认为EHEC的主要毒力因子有志贺毒素、致病性大质粒和LEE毒力岛。EAggEC主要与小儿顽固性腹泻有关 EAggEC产生束状菌毛（AFF/）和聚集性粘附大肠杆菌毒素（EAST ）AFF/和EAST 的基因位于60MD质粒上样品的采集与处理样品的采集与处理 肠道外感染患者，应根据感染情况采取中段尿、血液、脓液、脑脊液、胆汁等。食品样品采集后应尽快检验，易腐食品在检验之前应予冷藏。粪便标本一般采集13ml水样便或
7、血样便，成形便约25g左右或用棉拭子采样，粪便标本应尽快送检，如运送时间超过2h，标本应放在Cary-Blair运送培养基内，4条件下送检。EPEC：婴幼儿水样或蛋花样便EIEC：细菌性痢疾样便ETEC：霍乱样水样便EHEC：早期为水样便，后为血便检验程序检验程序肠道增菌肉汤检样麦康凯371 18-24h乳糖发酵或不发酵的菌落3-5个、氧化酶，G杆菌TSI、靛基质、pH7.2尿素、KCN、赖氨酸、动力TSI底部+，H2S-，KCN-，尿素-如非左述的反应结果血清学试验进一步鉴定非大肠埃希氏菌报告直接分离培养直接分离培养 新鲜粪便标本接种下列培养基麦康凯（Mac）或伊红-美蓝等弱选择性鉴别培养基
8、。山梨醇-麦康凯琼脂或O157显色培养基，肠出血性大肠杆菌及某些致病性大肠杆菌不发酵或迟缓发酵山梨醇，菌落为无色。血琼脂平板，用于观察肠致病性大肠杆菌的溶血及其他菌落的鉴别，37培养18-24h观察结果。增菌培养增菌培养 对于怀疑肠出血性大肠杆菌O157:H7感染标本，应无菌称取25g食品或环境采集样品，加入225ml mEC+n（m为modified“改良的”的缩写，n为novobiocin“新生霉素”的缩写）肉汤中，37增菌培养6h，免疫磁珠捕获后转种于改良的O157显色培养基或CT-SMAC，37培养18-24h观察结果。磁珠分离磁珠分离 将Ep管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1
9、只Ep管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每个Ep管的盖子，每管加入20LE.coli O157免疫磁珠悬液。注意：磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可剧烈震荡，避免产生泡沫。取mEC+n肉汤增菌培养物1mL，加入到Ep管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换1只加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。在1830环境中，将上述Ep管连同磁板架放在适合的装置上转动或用手轻微转动10min，使E.coli O157与免疫磁珠充分接触。将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上的免疫磁珠
10、全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见的圆形或椭圆形棕色聚物。取1支灭菌的加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复2.4步骤。每个样品换用1支加长吸管。某些样品特别是那些富含脂肪的样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸取上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50100L上清液于Eppendorff管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。从磁板架上移走磁板，在每个E
11、ppendorff中加入1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.42.6。用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50L免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于361培养1824h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板表面水分过多时，应在37下干燥1020min，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。大肠杆菌在选择性琼脂平板上的菌落特征大肠杆菌在选择
12、性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板菌落特征麦康凯琼脂大肠杆菌发酵乳糖，在麦康凯琼脂上呈桃红色不透明菌落伊红美蓝琼脂黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落O157显色培养基肠出血性大肠杆菌O157：H7呈紫红色或浅紫色菌落山梨醇麦康凯琼脂肠出血性大肠杆菌O157：H7呈不发酵山梨醇的乳白色菌落或迟缓发酵山梨醇的红色菌落大肠杆菌在MAC上生化反应生化反应 从鉴别平板上挑取5个可疑菌落，分别接种KIA或TSI，靛基质试纸片，37培养18-24h。凡分解乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多数产气，H2S阴性，靛基质阳性的菌
13、株，可鉴定为大肠杆菌。如果靛基质阴性，且V-P试验阴性，在西蒙式枸橼酸盐琼脂上不生长，才可证实为大肠杆菌。肠侵袭性大肠杆菌常不分解乳糖。血清学试验血清学试验 挑取生化反应符合的菌落与大肠杆菌多价血清作玻片凝集试验，阳性者再以该多价血清包含的单价血清进一步鉴定。并作盐水对照。多价1：O55、O86、O111、O127多价2：O26、O125、O126、O128多价3：O44、O112、O119、O124多价1：O28、O29、O112、O124多价2：O136、O143、O144、O152、O164多价1：O86、O111、O127多价2：O26、O44、O114、O126、O142多价3：O55、O119、O125、O146多价4：O6、O8、O20、O25多价5：O1、O27、O78、O128、O148、O149多价6：O28、O112、O124、O136、O143、O144多价7：O63、O152、O158、O159 其中，多价1，2，3包含EPEC的O因子；多价4，5包含ETEC的O因 子；多价6包含EIEC的O因子。
