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1、脂质体的制备脂质体的制备脂质体的制备脂质体的制备脂质体的制备脂质体的制备及检测及检测及检测及检测及检测及检测1、目的要求、目的要求2、实验原理、实验原理3、试剂与器材、试剂与器材4、实验步骤、实验步骤5、注意事项、注意事项6、思考题、思考题目的要求目的要求目的要求目的要求目的要求目的要求1.掌握注入法制备脂质体的工艺。2.掌握脂质体包封率的测定方法。实验原理实验原理实验原理实验原理实验原理实验原理 60年代初，Begkan等发现磷脂分散在水中可形成多层囊，并证明每层囊均为双分子脂质膜且被水隔开，称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。1971年Rymen等人提出将脂质体作为药物载体，即将酶或药物包裹
2、在脂质体中。脂质体系一种人工细胞膜，它具有洋葱似的封闭球形脂质体系一种人工细胞膜，它具有洋葱似的封闭球形结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用，特结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用，特别适于作为抗痼药物载体，以改善药物的治疗作用，降低别适于作为抗痼药物载体，以改善药物的治疗作用，降低毒副作用等。毒副作用等。脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等，合成磷脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等，合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬
3、脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，形成椭圆水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，形成椭圆形或球状结构一形或球状结构一脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制
4、备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂其它附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。质体表面电荷的性质。脂质体载药系统的优势：脂质体载药系统的优势：1.被动靶向：脂质体进人体内可被巨噬细胞作为外界异物被动靶向：脂质体进人体内可被巨噬细胞作为外界异物而吞噬，主要被单核巨噬细胞系统的巨噬细胞所吞噬而吞噬，主要被单核巨噬细胞系统的巨噬细胞所吞噬而摄取，形成肝、脾等网状内皮系统的被动靶向性。而摄取，形成肝、脾等网状内皮系统的被动靶向性。2.缓释作用：将
5、药物包封成脂质体，可减少肾排泄和代谢，缓释作用：将药物包封成脂质体，可减少肾排泄和代谢，延长药物在血液中的滞留时间，使药物在体内缓慢释延长药物在血液中的滞留时间，使药物在体内缓慢释放，从而延长了药物的作用时间。放，从而延长了药物的作用时间。3.降低药物毒性：药物被脂质体包封后，有效地在肝、脾降低药物毒性：药物被脂质体包封后，有效地在肝、脾和骨髓等单核巨噬细胞较丰富的器官中浓集，对心、和骨髓等单核巨噬细胞较丰富的器官中浓集，对心、肾有毒性的药物或对正常细胞有毒性的抗癌药包封脂肾有毒性的药物或对正常细胞有毒性的抗癌药包封脂质体后，可明显降低药物的毒性。质体后，可明显降低药物的毒性。4.提高稳定性：
6、一些不稳定的药物被脂质体包封后，可受提高稳定性：一些不稳定的药物被脂质体包封后，可受到脂质体双层膜的保护。到脂质体双层膜的保护。常用的脂质体制备方法：常用的脂质体制备方法：注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法。向蒸发法。脂质体作为药物载体的应用：脂质体作为药物载体的应用：1、抗肿瘤药物载体：、抗肿瘤药物载体：2、抗寄生虫药物载体：、抗寄生虫药物载体：3、抗菌药物载体：、抗菌药物载体：4、激素类药物载体。、激素类药物载体。脂质体可分为三类：脂质体可分为三类：小单室小单室(层层)脂质体：脂质体：粒径在2050nm，凡经超声波处理的 脂质体混悬液，绝大部分
7、为小单室脂质体；多室多室(层层)脂质体：脂质体：粒径约在4003500nm；大单室脂质体：大单室脂质体：粒径约为2001000nm，用乙醚注入法制备 的脂质体多属这一类。脂质体包封脂质体包封(裹裹)率的测定率的测定：包封率（C总-C游离）/C总 100 式中C总-脂质体混悬液中的药物浓度 C游离-未包入脂质体中的药物浓度 影响脂质体包封率的因素有多种，如磷脂质的种类，组成比例，制备方法及介质的离子强度等。包封率的测定方法：包封率的测定方法：凝胶过滤法：常用凝胶为Sephadex（羟丙基葡聚糖凝胶）G50、G100或Sephrouse（琼脂糖凝胶）4B、6B。超速离心法 透析法 超滤膜过滤法 脂
8、质体的制法脂质体的制法有多种，可按药物性质或需要进行选择。薄膜分散法薄膜分散法：是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声 处理，得到小单室脂质体。特点是操作简便，但包封率 较低。注入法注入法：根据所用溶解磷脂质的溶剂，可分为乙醚注入法和乙醇注入 法。乙醚注入法是将磷脂、胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等 溶于适量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴入5060水性溶液 中，蒸去乙醚，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备 脂质体。本实验采用此法制成脂质体，安定为模型药物。乙 醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留1020 乙醇。最近还有人研究用Freon为溶剂溶解磷脂质等脂溶性成 分，采用注入法制备脂
9、质体。此法适于不耐热的药物。反相蒸发法反相蒸发法：是制备多层脂质体或大单室脂质体的方法，此法包封率 高。冷冻干燥法冷冻干燥法：适于在水中不稳定的药物制备脂质体。熔融法熔融法：适于制备多相脂质体，制得的脂质体稳定，可加热灭菌。试剂与器材试剂与器材试剂与器材试剂与器材试剂与器材试剂与器材1.试剂：水杨酸 、卵磷脂、胆固醇 生理盐水2.器材：磁力搅拌器、光学显微镜、超滤 器、分光光度计 实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤1.处方 水杨酸 0.25g 卵磷脂 2g 胆固醇 0.2g 生理盐水 加至50ml2.操作(1)磷脂、胆固醇乙醇溶液的配制：取处方量的卵磷脂、胆固醇溶于1520ml的
10、乙醇中，即得。(2)水杨酸脂质体的制备：取生理盐水约30ml于50ml烧杯中，置磁力搅拌器上，加热至5060，将含卵磷脂、胆固醇的乙醇液慢慢滴加于生理盐水中后继续搅拌约10min.，加入水杨酸后保持温度60，使乙醇完全蒸发除去，再继续搅拌2h，加生理盐水至50ml，取下磁力搅拌器，镜检，即得。3.质量检查与评定(1)脂质体的形态与粒度：显微镜（油镜）(2)异物：显微镜下观察有无异物。(3)包封率的测定（超速离心法）：取1.0ml水杨酸脂质体混悬液置离心机上，10000转/分离心5分钟。取0.1ml上清液置试管内，加蒸馏水9.9ml，摇匀，加入2ml硫酸铁胺溶液在530nm波长处测定吸光度，由标
11、准曲线计算未包入脂质体中水杨酸的浓度。注意事项注意事项注意事项注意事项注意事项注意事项(1)溶解磷脂和胆固醇的乙醇溶液应澄清，否则需过溶解磷脂和胆固醇的乙醇溶液应澄清，否则需过滤除去杂质。滤除去杂质。(2)乙醇液的注入，可用乙醇液的注入，可用lml的注射器或细滴管滴至的注射器或细滴管滴至生理盐水的内部，每滴一滴，须使产生的泡沫消生理盐水的内部，每滴一滴，须使产生的泡沫消失后再加第二滴。失后再加第二滴。(3)整个实验过程中，温度可控制在整个实验过程中，温度可控制在5060，操作，操作中始终伴随搅拌，加入安定后搅拌的时间不得少中始终伴随搅拌，加入安定后搅拌的时间不得少于于2h，因脂质体形成有个过程，温度、滴加速度，因脂质体形成有个过程，温度、滴加速度和搅拌时间对脂质体的形成均有影响。和搅拌时间对脂质体的形成均有影响。思考题思考题思考题思考题思考题思考题1.注入法制备脂质体成败的关键是什么？2.制备脂质体时加入胆固醇的目的是什么？
