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1、7 菌种筛选方法菌种筛选方法 所有的微生物育种工作都离不开菌种筛所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的0.050.2。微生物的正突变概率极小，。微生物的正突变概率极小，产量提高产量提高10以上突变株也只有以上突变株也只有1/300。微生物的突变类型多，可分为两大类，微生物的突变类型多，可分为两大类，
2、第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株，形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株，包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突变型，产量突变等。变型，产量突变等。因此，因此，要在大量的细胞中寻找真正需要要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。关键。在提高筛选品质方面，由于过去对菌在提高筛选品质方面，由于过去对菌体生理了解不够，只能体生理了解不够，
3、只能随机筛选（随机筛选（random selection），大量筛选无特定标记的突变株，大量筛选无特定标记的突变株，因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研究，以及由实际研发的经验，发展出究，以及由实际研发的经验，发展出合理合理定向筛选（定向筛选（rational selection）技术。技术。菌种筛选方案菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛初筛的目的是删去明确不符合要求的大部的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量
4、保留分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，以多为，主使优良菌种不致于漏网。下来，以多为，主使优良菌种不致于漏网。复筛复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，的目的是确认符合生产要求的菌株，以质和精为主，应精确测定每个菌株的生以质和精为主，应精确测定每个菌株的生产指标。产指标。筛选方案：筛选方案：第三轮、第四轮第三轮、第四轮(操作同上操作同上)初筛和复筛工作可以连续进行多轮，初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很效果，而且，
5、还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。筛选获得的优良菌株还将进一步做工筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。等的适应性及遗传稳定性。8 抗性筛选抗性筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有只要有106频率的突变体存在，就容易频率的突变体存在，就容易筛选出来。筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。选法和阶梯性筛选法两种手段。1）一次性筛选法）一次性筛选
6、法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生体突变株能在
7、这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。株。耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。细胞则对高温有较好的耐受性。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以在于它可以节约冷却水节约冷却水的用量，尤其是在的用量，尤其是在夏季，并能夏季，并能减少染菌减少染菌的机会。耐高温菌株的机会。耐高温菌株所产生所产生
8、酶的热稳定性酶的热稳定性较高，适用于一些特较高，适用于一些特殊的工艺过程。殊的工艺过程。耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。渗环境下一次性筛选获得。2）阶梯性筛选法）阶梯性筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培
9、养基中药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。性筛选法。因为药物抗性常受因为药物抗性常受多位点基因多位点基因的控制，的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间所
10、以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经而对高浓度药物敏感，经“驯化驯化”或诱变处或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏。阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株遗漏。
11、阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。接受的药物浓度情况下。(1)梯度平板法梯度平板法(Gradient plate)先将先将10ml左右的一般左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度的含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到层培养基越薄的部位
12、，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。形成的明显界线。梯度平板法也常用于梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株
13、抗代谢拮抗物突变株的筛选，的筛选，以提高相应代谢产物的产量。以提高相应代谢产物的产量。异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产的。这样，通过梯
14、度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。吡哆醇的高产菌株。图图 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌代谢产物代谢产物生产菌生产菌代谢拮抗物代谢拮抗物肌苷肌苷肌苷肌苷腺嘌呤腺嘌呤烟碱酸烟碱酸色氨酸色氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸酪氨酸酪氨酸亮氨酸亮氨酸吡咯叠氮吡咯叠氮短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌棒杆菌棒杆菌鼠伤寒沙门氏杆菌鼠伤寒沙门氏杆菌衣藻衣藻伤寒沙门氏杆菌伤寒沙门氏杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌伤寒沙门氏杆菌伤寒沙门氏杆菌金色假单胞菌金色假单胞菌8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤6-巯鸟嘌呤巯鸟嘌呤2,6-
15、二氨基嘌呤二氨基嘌呤3-乙酰吡啶乙酰吡啶6-甲基色氨酸甲基色氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸三氯三氯-DL-亮氨酸亮氨酸6-氟色氨酸氟色氨酸 阶梯性筛选法也有一定的缺点，阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。此，漏检的几率较大。(2)纸片扩散法纸片扩散法 纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，纸片扩散法与梯度平板法的原理
16、类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。是抗性菌。9 推理选育推理选育(Rational Selection)抗生素产生菌的推理选育是建立在抗抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素生物合成机制已知或较清楚的基础上生素生物合成机制已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。按需要定向选育的一种方法。近几年研究近几年研究较多，应用较广，成效显著。就一些抗生较多，应用较广，成效显著。就一些抗生素而言，经过多年的研究，其代谢机理已素而言，经过多年的研究，其代谢机理已较清楚。实践证明，推理选育在抗生素育较清楚。实践证明，推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多，只需适量筛选，即可达到所期望
