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1、第二章第二章 蛋白质结构分析蛋白质结构分析 第二节第二节 蛋白质的化学裂解蛋白质的化学裂解 裂解于甲硫氨酸裂解于甲硫氨酸(Met)溴化氰溴化氰(BrCN)是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧羧基端，对多数蛋白质裂解效率为基端，对多数蛋白质裂解效率为90以上。以上。BrCN在酸性条件下，在酸性条件下，裂解在甲硫氨酸的裂解在甲硫氨酸的C端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸()(homoserine)和高丝氨酸内酯和高丝氨酸内酯(I)(homoserinelactone)的混合物，的混合物，它们之间也能相互转化，如图它们之间也
2、能相互转化，如图2.1所示。所示。对对Met-Thr、Met-Ser键，则常常是低产率的，可能是键，则常常是低产率的，可能是羟基产生下羟基产生下面的一系列反应面的一系列反应(和和)，最后形成高丝氨酸残基，最后形成高丝氨酸残基(V)，而未裂解此肽，而未裂解此肽键，如图键，如图2.2所示。所示。Met-Cys键也不易裂解。键也不易裂解。典型的反应常常在典型的反应常常在20、70甲酸甲酸(V/V)中进行中进行24h，副反应是部分副反应是部分Asp-Pro键会断裂，一些酰胺基团会部分丢键会断裂，一些酰胺基团会部分丢失，部分失，部分Asn-Gly会产生重排或环化，有时会产生重排或环化，有时Trp会氧化。
3、会氧化。操作：蛋白质先用操作：蛋白质先用5巯基乙醇在巯基乙醇在pH 8.0室温下处理室温下处理24h，加色胺，加色胺(tryptamine)或色氨酸或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸计算分子色胺或色氨酸计算)以防止色氨酸氧化。以防止色氨酸氧化。蛋白质以蛋白质以15mg/ml浓度溶解在浓度溶解在70甲酸中，加入甲酸中，加入50倍倍过量，小体积的过量，小体积的BrCN/70甲酸，通氮并置于暗处，室温甲酸，通氮并置于暗处，室温放置放置1624h，结束后加，结束后加15倍体积的水，冻干，重复加水倍体积的水，冻干，重复加水冻干。冻干。第三节第三节 蛋白水解酶酶解蛋白水解酶酶
4、解一、一、常用蛋白水解酶常用蛋白水解酶(1)胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)专一作用在专一作用在Arg和和Lys(碱性氨基酸碱性氨基酸)的羧基端，但对的羧基端，但对Arg-Pro和和Lys-Pro键没作用。键没作用。我们常将胰蛋白酶配成我们常将胰蛋白酶配成1mg/ml，贮存在，贮存在1mmol/LHCl中，中，-20保存数月，而未观察到酶的活性损失。如果样品溶解度差，可适量加入尿保存数月，而未观察到酶的活性损失。如果样品溶解度差，可适量加入尿素增加溶解度，因为胰蛋白酶在素增加溶解度，因为胰蛋白酶在2mol/L尿素中，仍具有充分的活性。尿素中，仍具有充分的活性。(2)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶(
5、-chymotrypsin)专一作用在芳香族氨基酸的羧基端。专一作用在芳香族氨基酸的羧基端。(3)内肽酶内肽酶Lys-C(endoproteinase Lys-c)专一作用在专一作用在Lys的羧基端。的羧基端。(4)V8蛋白酶蛋白酶(staphylococcal protease)专一作用在专一作用在Asp和和Glu(酸性氨基酸酸性氨基酸)的羧基端。的羧基端。pH 8.0的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液时，作用在时，作用在Glu-X和和Asp-X；pH 4.0的乙酸缓冲液时，仅作用于的乙酸缓冲液时，仅作用于Glu-x键。键。(5)梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶(clostripain)专一作用在专一作用在Arg
6、的羧基端。的羧基端。(6)凝血酶凝血酶(thrombin)专一裂解在专一裂解在Arg-Gly键上，在纤维蛋白原工作中，很大程键上，在纤维蛋白原工作中，很大程度上还依赖于邻近氨基酸序列。近来还常用作融合蛋白的裂度上还依赖于邻近氨基酸序列。近来还常用作融合蛋白的裂解点。解点。(7)其他其他 还有专一性较广的胃蛋白酶还有专一性较广的胃蛋白酶(pepsin)、枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶(papain)、嗜热菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)等。等。应该指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均从胰脏制备，常常不应该指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均从胰脏制
7、备，常常不易完全分开，而是你中有我，我中有你，专一性不佳，易造易完全分开，而是你中有我，我中有你，专一性不佳，易造成混乱。应采购成混乱。应采购TPCK胰蛋白酶胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活抑制了胰凝乳蛋白酶活性性)和和TLCK胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白抑制了胰蛋白-酶活性，才能保酶活性，才能保证酶的专一性。证酶的专一性。三、三、讨讨 论论(1)蛋白质的量和浓度蛋白质的量和浓度 酶解不能正常进行的主要原因之一是蛋白质的量不足。精确定量蛋白酶解不能正常进行的主要原因之一是蛋白质的量不足。精确定量蛋白质是必需的，一般用氨基酸分析来定量微量的蛋白质。质是必需的，一般用氨基酸分析来定量微量的
8、蛋白质。蛋白质浓度通常要求蛋白质浓度通常要求500g/ml，最少不得低于，最少不得低于100g/ml，否则酶，否则酶的消化难以进行，体积在的消化难以进行，体积在50100l。(2)缓冲液、盐和去垢剂缓冲液、盐和去垢剂 酶作用可以被缓冲液中的各种因子所抑制或完全阻止。在标准的酶作用可以被缓冲液中的各种因子所抑制或完全阻止。在标准的2mol/L尿素，尿素，0.1mol/L NH4HCO3系统中，系统中，SDS含量为含量为0.0005时，就会影响酶的消化。时，就会影响酶的消化。0.005SDS会减少许多酶解肽段的产量。类会减少许多酶解肽段的产量。类似的，染料考马斯兰和两性电介质也会阻止酶的消化。高浓
9、度的盐似的，染料考马斯兰和两性电介质也会阻止酶的消化。高浓度的盐(1mol/L NaCl)也会影响蛋白水解酶的活性；也会影响蛋白水解酶的活性；2mol/L以上浓度的尿素以上浓度的尿素会影响羧甲基化和蛋白酶的消化。会影响羧甲基化和蛋白酶的消化。(3)羧甲基化羧甲基化 Stone等报道，转铁蛋白用酶解时，羧甲基化的转铁蛋白酶解很好，等报道，转铁蛋白用酶解时，羧甲基化的转铁蛋白酶解很好，而没有羧甲基化的转铁蛋白，酶解程度很差。而没有羧甲基化的转铁蛋白，酶解程度很差。(4)蛋白酶的量蛋白酶的量 酶和蛋白质的质量比为酶和蛋白质的质量比为1:25，如果分子质量大，如果分子质量大的蛋白质的蛋白质(6万万Da
10、)，则比例要减低至，则比例要减低至1:50。胰蛋。胰蛋白酶要用序列级的商品。白酶要用序列级的商品。(5)原位酶解原位酶解 将将SDS-PAGE上的蛋白质样品从凝胶上解析下来上的蛋白质样品从凝胶上解析下来是很困难的，文献报道有很多方法，但实用性差。是很困难的，文献报道有很多方法，但实用性差。目前流行的方法是将蛋白质电印迹目前流行的方法是将蛋白质电印迹(blotting)至至PVDF类的膜上，直接进行序列分析或类的膜上，直接进行序列分析或直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析直接在膜上进行酶解，后者称为原位分析(in situ)。原位酶解操作如下：膜片剪成原位酶解操作如下：膜片剪成lmm细条，放在细
11、条，放在Eppendrof管中管中,加加1.2ml 0.5(m/V)PVP-40/0.1mol/L HAc，37保温保温30min，PVP-40的作用是阻止在酶解时蛋白酶吸附到硝酸纤维素膜上，除去的作用是阻止在酶解时蛋白酶吸附到硝酸纤维素膜上，除去PVP-40后，用水充分洗涤膜至少后，用水充分洗涤膜至少5次以洗净残留的次以洗净残留的PVP-40(因为因为PVP-40有很强的紫外吸收，在有很强的紫外吸收，在RP-HPLC中，中，PVP-40于于30一一40有机溶有机溶剂浓度时洗下来，它在剂浓度时洗下来，它在215220nm有很高的吸收，在有很高的吸收，在260289nm吸收很小吸收很小)，所以在
12、，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解时的缓冲液漂前需完全除去。膜片再用酶解时的缓冲液漂洗，然后进行酶解，一般蛋白酶在洗，然后进行酶解，一般蛋白酶在100mmol/L NH4HCO3:CAN=95:5，pH8.2，37酶解过夜，对酶解过夜，对V8蛋白酶则在蛋白酶则在100mmol/L磷酸磷酸钠钠:ACN=95:5，pH 7.8，室温过夜。酶与底物之比为，室温过夜。酶与底物之比为1:10至至1:20(质质量比量比)；对亚微克级样品，酶与底物之比高达；对亚微克级样品，酶与底物之比高达2:1。酶解后。酶解后-20保存或保存或立刻用数微升立刻用数微升10TFA酸化，上样到酸化，上样到HPLC柱上分
13、析。柱上分析。(6)限制性酶解限制性酶解 限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例限制性酶解有助于蛋白质测序时的序列演绎。最著名的例子是核糖核酸酶子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草杆菌蛋白水解酶在，它被枯草杆菌蛋白水解酶在pH 8.0下作用，活性没有变化，但出现一个新的下作用，活性没有变化，但出现一个新的N端丝氨酸。端丝氨酸。用用AmberliteIRC-50离子交换柱，离子交换柱，0.2mol/L pH6.25的磷酸的磷酸钠缓冲液可分离到一个大片段钠缓冲液可分离到一个大片段(S蛋白蛋白)和一个小片段和一个小片段(S肽肽)。也可用三氯乙酸也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是
14、沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上层蛋白，上层液部分是液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。第四节第四节 蛋白质中存在着封闭的蛋白质中存在着封闭的N端端 有些蛋白质的有些蛋白质的N端是封闭的，尤其在腹水细胞中，端是封闭的，尤其在腹水细胞中，80的蛋白质的的蛋白质的N端是乙酰化的，因此用端是乙酰化的，因此用Edman法不能直接测定其序列，要用一系列的化法不能直接测定其序列，要用一系列的化学或酶处理。学或酶处理。如果在蛋白质如果在蛋白质/肽序列仪上测定不到序列，蛋白质的量肯定又是足够肽序列仪上测定不到序列，蛋白质的量肯定又是足够的，则可在仪器上进一步用
15、含水的，则可在仪器上进一步用含水TFA(三氟乙酸三氟乙酸)处理样品，使蛋白质酸处理样品，使蛋白质酸水解成许多肽段后再测序，这时会有很多水解成许多肽段后再测序，这时会有很多PTH-氨基酸出现，以此反证此氨基酸出现，以此反证此蛋白质的蛋白质的N端是封闭着的，再用下述方法除去封闭着的端是封闭着的，再用下述方法除去封闭着的N端。端。首先，用温和的酸处理可以除去甲酰化的甲硫氨酸首先，用温和的酸处理可以除去甲酰化的甲硫氨酸(f-Met)，也可能，也可能引起丝氨酸、苏氨酸的乙酰化引起丝氨酸、苏氨酸的乙酰化N-O重排反应。如果酸处理后还是测不到重排反应。如果酸处理后还是测不到序列，则进一步用焦谷氨酸氨肽酶除去
16、蛋白质序列，则进一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白质N端上的焦谷酰基；假设端上的焦谷酰基；假设这一方法仍不见效，再用较强的酸处理或其他酶处理。虽然有乙酰氨基这一方法仍不见效，再用较强的酸处理或其他酶处理。虽然有乙酰氨基酸释放酶酸释放酶(acylaminoacid-releasing enzyme，AARE)，但它不能作，但它不能作用长度在用长度在20个氨基酸残基以上的蛋白质或肽。因此，封闭的蛋白质首先个氨基酸残基以上的蛋白质或肽。因此，封闭的蛋白质首先裂解成小肽，再用裂解成小肽，再用AARE处理除去处理除去N端上的乙酰化氨基酸转变成端上的乙酰化氨基酸转变成n-1肽，肽，然后然后n-1肽的序列再用肽的序列再用Edman法测定。法测定。一、除去蛋白质中封闭的一、除去蛋白质中封闭的N-乙酰丝氨酸和乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸乙酰苏氨酸 样品置于样品置于1.5ml的聚丙烯离心管中，加无水的聚丙烯离心管中，加无水TFA，密闭，密闭，40保温保温1h，然后打开管盖，让，然后打开管盖，让TFA挥发，干燥，再进行序列分析。挥发，干燥，再进行序列分析。二、除去二、除去N-甲酰甲硫氨酸甲酰甲硫氨酸 样品置于样品置
