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1、输血和输血技术试验实验内容实验内容血型鉴定血型鉴定抗体筛选抗体筛选交叉配血交叉配血血型鉴定血型鉴定目的目的掌握红细胞掌握红细胞ABO血型及血型及Rh血血型鉴定型鉴定 原理原理lABO血型鉴定：根据红细胞上有无血型鉴定：根据红细胞上有无A抗原或（和）抗原或（和）B抗原，以及血清中有无抗抗原，以及血清中有无抗A及抗及抗B，可以将血型分为，可以将血型分为A型、型、B型、型、AB型、型、O型四种，利用红细胞凝集实验通型四种，利用红细胞凝集实验通过正定型、反定型准确鉴定过正定型、反定型准确鉴定ABO血型。血型。lRh血型鉴定：血型鉴定：IgM型盐水抗型盐水抗D试剂能够与试剂能够与D阳性红细阳性红细胞在盐
2、水介质中形成肉眼可见的凝集。胞在盐水介质中形成肉眼可见的凝集。原理原理l试剂试剂 抗抗A及抗及抗B血清（商品试剂）血清（商品试剂）5%A型和型和B型红细胞（试管法）型红细胞（试管法）10%A型和型和B型红细胞（玻片法）型红细胞（玻片法）IgM型盐水抗型盐水抗D试剂试剂l标本标本 抗凝静脉血抗凝静脉血 EDTA-K2 红细胞红细胞ABO血型鉴定（试管法正定型）血型鉴定（试管法正定型）标记两支干净的试管标记两支干净的试管-A和和-B在标记为在标记为-A的试管中加的试管中加1滴抗滴抗A试剂。试剂。在标记为在标记为-B的试管中加的试管中加1滴抗滴抗B试剂。试剂。在每个试管中各加入在每个试管中各加入5%
3、受检者红细胞悬液受检者红细胞悬液 (1份压积红细胞份压积红细胞+19份份0.9%盐水盐水)轻轻混匀，轻轻混匀，1000g离心离心1分钟。分钟。检查上清液是否有溶血。检查上清液是否有溶血。轻轻重悬细胞扣，检查凝集。轻轻重悬细胞扣，检查凝集。红细胞红细胞ABO血型鉴定（试管法反定型）血型鉴定（试管法反定型）标记两支干净的试管标记两支干净的试管Ac和和Bc每管加入每管加入2滴受检者血清。滴受检者血清。在标记在标记Ac的试管中加入的试管中加入1滴滴5%A型试剂红细胞。型试剂红细胞。在标记在标记Bc的试管中加入的试管中加入1滴滴5%B型试剂红细胞。型试剂红细胞。轻轻混匀，轻轻混匀，1000g离心离心1分
4、钟。分钟。检查上清有无溶血。检查上清有无溶血。轻轻重悬细胞扣，检查凝集。轻轻重悬细胞扣，检查凝集。判断并记录结果。判断并记录结果。红细胞红细胞ABO血型鉴定（玻片法）血型鉴定（玻片法）在标记的玻板上分别加一滴抗在标记的玻板上分别加一滴抗A、抗、抗B。各加一滴各加一滴10%受检者红细胞悬液受检者红细胞悬液 (1滴压积红细胞滴压积红细胞+9滴滴0.9%盐水盐水)轻轻混匀，室温放置轻轻混匀，室温放置2-15分钟。分钟。观察并记录结果：凝集为阳性结果，不凝集为阴观察并记录结果：凝集为阳性结果，不凝集为阴性结果，对结果有怀疑，应用试管法重新实验。性结果，对结果有怀疑，应用试管法重新实验。红细胞红细胞Rh
5、血型鉴定血型鉴定试管法试管法标记一支标记一支7512mm的试管的试管加入抗加入抗D血清血清1滴，滴，加加1滴滴5%的待检细胞。的待检细胞。轻轻混匀，轻轻混匀，1000g离心离心1分钟，或分钟，或3000r/min，15秒。秒。检查是否溶血，然后轻轻重悬细胞扣，检查凝集检查是否溶血，然后轻轻重悬细胞扣，检查凝集玻片法玻片法在玻板上标记待检红细胞编号。在玻板上标记待检红细胞编号。加入抗加入抗D血清血清1滴于标记玻片中。滴于标记玻片中。将将3545%的待检细胞的待检细胞1滴滴入玻片并混匀。滴滴入玻片并混匀。室温放置室温放置2分钟左右观察结果。分钟左右观察结果。结果判读（结果判读（ABO血型鉴定）血型
6、鉴定）正定型正定型反定型反定型血型血型抗抗A抗抗BA细胞细胞B细胞细胞O细胞细胞-+-O+-+-A-+-B+-AB结果判读（结果判读（Rh血型鉴定）血型鉴定）阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照待检细胞待检细胞结果结果+-+-报告方式报告方式 XXX型，型，Rh+/-注意事项注意事项玻片、试管都要标记！玻片、试管都要标记！A及及B标准血清绝对不能相混标准血清绝对不能相混,不要依靠不要依靠用染料颜色标记血清。用染料颜色标记血清。所用玻片、试管实验前必须清洗干净，以免出现假凝集现象。所用玻片、试管实验前必须清洗干净，以免出现假凝集现象。红细胞悬液滴管头不能接触标准血清液面，红细胞悬液滴管头不能接触标准
7、血清液面，一般先加血清，再加红细胞悬液，便于核实是否漏加血清。一般先加血清，再加红细胞悬液，便于核实是否漏加血清。离心时间、速度严格要求。离心时间、速度严格要求。要在光亮的背景下观察凝集要在光亮的背景下观察凝集,可使用光镜检查小的凝集可使用光镜检查小的凝集,同时应注意同时应注意观察凝集强度，有助于观察凝集强度，有助于A、B亚型的发现，观察后立即记录。亚型的发现，观察后立即记录。抗体筛选抗体筛选目的目的 掌握抗体筛选的试验方法掌握抗体筛选的试验方法 l盐水试验法盐水试验法l白蛋白介质法白蛋白介质法l低离子强度介质法（低离子强度介质法（LISS）l酶技术酶技术l抗球蛋白试验抗球蛋白试验l聚凝胺促凝
8、技术聚凝胺促凝技术lPEG促凝技术促凝技术原理原理抗人球蛋白法：抗人球蛋白法：IgG类抗体，由于其分子量小，与红细胞结合以后类抗体，由于其分子量小，与红细胞结合以后在盐水介质中不发生肉眼可见的凝集，称为不完全在盐水介质中不发生肉眼可见的凝集，称为不完全抗体。但在加入抗抗体。但在加入抗-IgG的抗体后，以其搭桥则可出的抗体后，以其搭桥则可出现凝集。现凝集。l试剂试剂 抗球蛋白试剂抗球蛋白试剂阳性对照血清阳性对照血清阴性对照血清阴性对照血清O型红细胞型红细胞生理盐水生理盐水l标本标本：抗凝静脉血（抗凝静脉血（EDTA-K2）操作步骤操作步骤在标记好的试管中各加入两滴血浆和一滴在标记好的试管中各加入
9、两滴血浆和一滴5%的的O型红细胞，混匀。型红细胞，混匀。于于370C孵育一小时。孵育一小时。用生理盐水洗涤红细胞用生理盐水洗涤红细胞4-6次，完全倾尽末次洗涤次，完全倾尽末次洗涤盐水。盐水。向得到的干细胞扣中加入向得到的干细胞扣中加入1-2滴抗球蛋白试剂。滴抗球蛋白试剂。1000rpm，离心，离心1分钟。检查凝集并记录结果。分钟。检查凝集并记录结果。结果判读结果判读加入抗球蛋白试剂后，如红细胞出现凝集或溶血，则加入抗球蛋白试剂后，如红细胞出现凝集或溶血，则结果为阳性。结果为阳性。加入抗球蛋白试剂后结果为阴性，而加入直抗阳性对加入抗球蛋白试剂后结果为阴性，而加入直抗阳性对照细胞后呈阳性反应，则结
10、果为阴性。如加入直抗阳照细胞后呈阳性反应，则结果为阴性。如加入直抗阳性对照细胞后呈阴性反应，则结果不可靠，必须重复性对照细胞后呈阴性反应，则结果不可靠，必须重复检测。检测。操作步骤阳性对照管阳性对照管待检管待检管阴性对照管阴性对照管IgGIgG型抗型抗D D1 1待检血清待检血清2 2阴性对照血清阴性对照血清2 25%O5%O型试剂红细型试剂红细胞胞1 11 11 1在标记好的试管中按下表加入试剂及血清在标记好的试管中按下表加入试剂及血清。ABO血型鉴定血型鉴定 不规则抗体筛选不规则抗体筛选玻片法（正定型）玻片法（正定型）试管法试管法（正定型（正定型,反定型）反定型）盐水法盐水法聚凝胺法聚凝胺
11、法抗人球法抗人球法 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术l达亚美微量定型系统凝胶测试法达亚美微量定型系统凝胶测试法 基于生物化学凝胶过滤技术和离心技术及免疫化基于生物化学凝胶过滤技术和离心技术及免疫化学抗原抗体特异反应。当抗原抗体反应，抗人球试学抗原抗体特异反应。当抗原抗体反应，抗人球试验时血细胞发生凝集。离心时凝集块不能通过凝胶验时血细胞发生凝集。离心时凝集块不能通过凝胶间隙而在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心间隙而在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心时可通过凝胶间隙而在凝胶底部，呈阴性反应。时可通过凝胶间隙而在凝胶底部，呈阴性反应。DiaMed 卡法结果判读卡法结果判读4 在凝胶柱顶端形
12、成单一层凝集细胞。在凝胶柱顶端形成单一层凝集细胞。3 凝集层主要位于凝胶柱上凝集层主要位于凝胶柱上1/3。2 凝集位于整个凝胶柱，底部仅有较少细胞。凝集位于整个凝胶柱，底部仅有较少细胞。1凝集层位于凝胶柱下凝集层位于凝胶柱下1/3。凝胶中细胞没有凝集或溶血视为阴性。凝胶中细胞没有凝集或溶血视为阴性。思考题思考题1.红细胞红细胞ABO血型鉴定正反定型不一致血型鉴定正反定型不一致原因原因 2.导致导致Rh血型鉴定出现假阳性和假阴性血型鉴定出现假阳性和假阴性原因原因3.抗体筛选的临床意义抗体筛选的临床意义交叉配血Cross Match目的目的 掌握交叉配血的试验方法掌握交叉配血的试验方法 原理原理盐
13、水法盐水法 检查供受者之间有无检查供受者之间有无ABO血型不合。用于抗体筛血型不合。用于抗体筛选阴性和不同血型骨髓移植患者的输血。选阴性和不同血型骨髓移植患者的输血。原理原理凝聚胺法凝聚胺法 凝聚胺是一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后能凝聚胺是一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红产生很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间的距离减少，能引起正常红细胞可逆性的非特细胞之间的距离减少，能引起正常红细胞可逆性的非特异性凝集。如果是抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，则异性凝集。如果是抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，则凝集不可逆。离心后，加入重悬液，
14、凝聚胺的凝聚作用凝集不可逆。离心后，加入重悬液，凝聚胺的凝聚作用可通过加入枸橼酸钠而中和，使正常红细胞的凝聚解散，可通过加入枸橼酸钠而中和，使正常红细胞的凝聚解散，而抗体引起的凝集仍然存在。而抗体引起的凝集仍然存在。l试剂试剂 抗抗A/抗抗B 标准血清标准血清A1/B反定型细胞反定型细胞献血者血清或血浆以及献血者血清或血浆以及5%红细胞悬液红细胞悬液受检者血清或血浆以及受检者血清或血浆以及5%红细胞悬液红细胞悬液BASO polymatching 试剂盒试剂盒 标本标本：抗凝静脉血（抗凝静脉血（EDTA-K2）操作步骤（盐水法）操作步骤（盐水法）标记为主侧的试管中加入受者血清或血浆标记为主侧的
15、试管中加入受者血清或血浆2滴和滴和供者红细胞悬液供者红细胞悬液1滴。滴。标记为次侧的试管中加入供者血清或血浆标记为次侧的试管中加入供者血清或血浆2滴和滴和受者红细胞悬液受者红细胞悬液1滴。滴。混匀，立即混匀，立即1000g离心离心1分钟。分钟。检查是否溶血，轻轻摇动试管检查凝集。检查是否溶血，轻轻摇动试管检查凝集。复查献血员复查献血员ABO血型，患者血型，患者ABO/Rh血型。血型。判断并记录结果。判断并记录结果。操作步骤（凝聚胺法）操作步骤（凝聚胺法）取试管取试管2支，标记主次侧支，标记主次侧在主侧管中加入病人血清或血浆在主侧管中加入病人血清或血浆2滴，加供血者滴，加供血者5%红红细胞悬液细
16、胞悬液1滴。滴。次侧管加供血者血清或血浆次侧管加供血者血清或血浆2滴，加入病人滴，加入病人5%红细胞红细胞悬液悬液1滴。滴。各加各加LIM液液0.7ml，混匀，再各加，混匀，再各加polybrene(凝聚胺凝聚胺)溶溶液液 2滴，并混合均匀。滴，并混合均匀。操作步骤（凝聚胺法）操作步骤（凝聚胺法）3400rpm离心离心10秒，倒掉上清液，管底残留约秒，倒掉上清液，管底残留约0.1ml液液体。体。轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重作。必须重作。最后加入悬浮液（最后加入悬浮液（Resuspending）2滴，轻轻转动试滴，轻轻转动试管混合并观察结果。管混合并观察结果。结果判读结果判读l如果如果30秒内凝集解散，代表是凝聚胺引起的非特异性秒内凝集解散，代表是凝聚胺引起的非特异性凝集，配血结果相合；凝集，配血结果相合；l如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血实验不相合。应，配血实验不相合。l如反应可疑，可进一步倒在玻片上用显微镜观察。如反应可疑，可进一步倒在玻片上用显微
