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1、1荧光分析法荧光分析法Fluorescence Analysis2荧光分析法荧光分析法第三版第三版 许金钩、王尊本主编，科学出版社许金钩、王尊本主编，科学出版社参考书参考书 一、一、分子荧光的产生过分子荧光的产生过程程二、二、荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系 三、三、影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素第一节第一节 分子荧光原理分子荧光原理 Principle of Fluorescence一、一、仪器与结构流程仪器与结构流程二、二、激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱三三、荧光分析法和应用荧光分析法和应用第二节第二节 分子荧光分析法分子荧光分析法Fluorescence
2、Analysis5一、荧光的产生过程一、荧光的产生过程 *分子能级分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级；动能级；*基态基态激发态激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；次到位；*激发态激发态基态基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；、激发态寿命最短的途径占优势；1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁62.2.电子激发态的
3、多重度电子激发态的多重度*大多数有机分子的大多数有机分子的基态基态处于单重态；处于单重态；*电子电子激发态激发态有有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向 M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)；*根据洪特规则，平行自旋（根据洪特规则，平行自旋（三重态三重态）比成对自旋（）比成对自旋（单重态单重态）稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；S0T1 属于禁阻属于禁阻跃迁，需要通过其跃迁，需要通过其他途径进入，而且他途径进入，而且进入的几率小；进入的几率小；73.3.激发态激
4、发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换外转换外转换系间窜越系间窜越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫9非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级
5、内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换内转换：同多重态电子能级中：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换不同能级间的无辐射能级交换 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发单重态的最低振动能级。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间窜
6、跃系间窜跃：不同多重态：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。10辐射能量传递过程辐射能量传递过程 S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间窜跃系间窜跃振动弛豫振动弛豫 T1 S0磷光发射磷光发射：电子由第一激发电子由第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态 （T1 S0跃迁跃迁）；）；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：的可能过程：发光速度很慢：发光速度很慢：10-410 s，即光照停止后，可持，即光照停止后，可持续一段时间。续一段时间。荧光发射荧光发射：第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态 （S1
7、S0跃迁跃迁）10-710-9s（S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）1112二、荧光的产生与分子结构的关系二、荧光的产生与分子结构的关系 发射荧光的分子数激发分子的总数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；1FnFiikFkk k kF F主要取决于化学结构，而主要取决于化学结构，而S Sk ki i则主要取决于则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。化学环境，同时也与结构有关。大多数荧光物质的量子产率在大多数荧光物质的量子产率在0.11之间。之间。132.2.有
8、机化合物的结构与荧光有机化合物的结构与荧光（1）跃迁类型跃迁类型：*的荧光效率高。这是因为的荧光效率高。这是因为 *跃跃迁的摩尔吸收系数比迁的摩尔吸收系数比 n *大，且大，且 *跃迁的寿命比跃迁的寿命比n *要短。要短。（2）共轭效应共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。移。（3）刚性平面结构刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。酚酞却没有。（4）取代
9、基效应取代基效应：芳环上有：芳环上有供电基，使荧光增强。重原子供电基，使荧光增强。重原子效应。效应。1415强荧光物质往往具备以下特征：强荧光物质往往具备以下特征：具有大的共轭具有大的共轭 键结构；键结构；具有刚性平面结构；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态具有最低的单线电子激发态S1为为 *型型 取代基团为给电子取代基取代基团为给电子取代基小结：小结：16 1.荧光强度和溶液浓度的关系荧光强度和溶液浓度的关系 荧光强度荧光强度 If正比于体系吸收的激发光的光强，即正比于体系吸收的激发光的光强，即：If=K(I0-I)由朗由朗-比耳定律：比耳定律：I/I0=10-b c代入，得：代入，
10、得：If=KI0(1-10-b c)将此式展开，即将此式展开，即三、影响荧光强度的因素三、影响荧光强度的因素 低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。023(2.3)(2.3)2!3!2.3FbcbcIK Ibc 浓度很低时，浓度很低时，bc 0.05，则可近似写成：，则可近似写成：If=2.3 I0 l c =Kc 定量分析的基础定量分析的基础172.2.溶剂的影响溶剂的影响 溶剂的介电常数越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大；溶剂的介电常数越大
11、，荧光峰的波长越长，荧光效率越大；含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光减弱；减弱；溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。变化。3.3.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加增加,从而导致荧光强度的下降。从而导致荧光强度的下降。影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素184.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需
12、要严格控制；OH-H+O-OHO-OH-H+有荧光有荧光无荧光无荧光无荧光无荧光有荧光有荧光NH3OHHNH2NHOHHpH13 无荧光19 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。碰撞猝灭碰撞猝灭 是荧光熄灭的主要原因。是荧光熄灭的主要原因。5.5.荧光的熄灭荧光的熄灭 氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。浓度越大、温度越高，碰撞机会越大浓度越大、温度越高，碰撞机会越大粘度越大，碰撞机会越小粘度越大，碰撞机会越小20一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由测量荧光
13、的仪器主要由五个部分五个部分组成：激发光源、样品组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录装置。池、双单色器系统、检测器、记录装置。特点特点：（与（与UV-visUV-vis仪器的比较）仪器的比较）有两个单色器，光源与检测有两个单色器，光源与检测器通常成直角。器通常成直角。两个单色器分别是：两个单色器分别是：1 1）选择激发光波长的第一）选择激发光波长的第一单色器单色器2 2）选择发射光）选择发射光(测量测量)波长波长的第二单色器的第二单色器2122检测器检测器：光电倍增管。光电倍增管。样品池样品池：材料：与材料：与UV-vis吸收池吸收池 相同。相同。形状：形状：？光源光源：氙灯和高
14、压汞灯，染料激光器氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围：氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围：200700nm,在在200400nm波段内，光谱强度几乎相等。波段内，光谱强度几乎相等。23仪仪器器光光路路图图24二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱 If ex(固定 em)光光源源第一第一单色单色器器第二第二单色单色器器激发激发荧荧光光样品样品池池检测系检测系统统1.荧光的激发光谱曲线荧光的激发光谱曲线2.荧光的发射光谱曲线荧光的发射光谱曲线（荧光光谱）（荧光光谱）If em (固定 ex)25粗步设定ex，扫描 em萘的激
15、发、荧光光谱萘的激发、荧光光谱exem相对强度相对强度固定em（最佳），扫描ex固定ex（最佳），扫描 em荧光（发射）光谱曲线II荧光激发光谱曲线 II荧光（发射）光谱曲线 IIIIIIII263.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 (1)Stokes (1)Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。(2)发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能
16、级，吸收不同波长的能量，产生产生不同吸收带，不同吸收带，但均回到但均回到第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级再跃再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。迁回到基态，产生波长一定的荧光。274.测定波长的选择测定波长的选择瑞利散色和拉曼散色瑞利散色和拉曼散色28三、荧光分析方法与应用三、荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。光强、荧光量子效率、荧光寿命等。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3 3）试样量少，应用范围广。）试样量少，应用范围广。（4 4）灵敏度高）灵敏度高 分析物浓度范围：分析物浓度范围：1010-5-5 1010-8-8 mol/Lmol/L，检测下限：，检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级。个数量级。29(1)(1)定性方法定性方法 任何荧光都具有两种特征光谱
