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1、Page 1Page 2实验流程实验流程:载体载体外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主细胞主细胞abbA重组重组Ab抗性筛选抗性筛选重组筛选重组筛选DNADNA重组技术重组技术Page 3质粒改造历程质粒改造历程阅读质粒图谱阅读质粒图谱实验常见问题及注意事项实验常见问题及注意事项 领域最新进展或现实意义领域最新进展或现实意义Page 4 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC10
2、1,colE1,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。发展概况发展概况质粒改造历程质粒改造历程Page 5 1）pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。最早应用于基因工程的载体之一。2）由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。3）把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的
3、新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。pBR32pBR322 2重要的大肠杆菌质粒载体Page 64）过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。Page 7pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr松弛型复制松弛型复制 p
4、BR322pBR322：氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50-100/50-100/cellcell用于基因克隆用于基因克隆 Page 8pUCpUC质粒系列质粒系列 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.Page 9三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插
5、入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。Page 10476bp476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基因的基因的 5-5-序列，序列，表达半乳糖苷酶的表达半乳糖苷酶的片段。片段。LacZLacZ的上游包括乳糖操纵的上游包括乳糖操纵子上的启动子子上的启动子PlacPlac和操纵和操纵基因基因O O。lacZlacZ之内是之内是M13M13的多功能的多功能连接器。连接器
6、。Page 11第一步：了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。选用哪种载体要以实验目的为准绳。第二步：再看筛选标记，如抗性.Ampr：水解p一内酰胺环，具氨苄抗性。tetr：阻止四环素进入细胞。camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor(kanr)：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。hygr：使潮霉素B失活。阅读质粒图谱阅读质粒图谱Page 12第三步：看多克隆位点（MCS）它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选
7、。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。Page 13合格质粒的组成要素合格质粒的组成要素1、复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。2、抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+,Kan+3、多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段4、P/E 启动子/增强子5、Terms 终止信号 6、加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用Page 14
8、载体选择载体选择1、构建DNA重组体的目的，选择合适的克隆载体/表达载体。2、载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力。（2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭。（3）对原核表达载体应该注意 3 点：选择合适的启动子及相应的受体菌；用于表达真核蛋白质注意阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。Page 15 克隆载体的必要性克隆载体的必要性 基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋
9、白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？表达载体是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？pcr产物直接酶切连接？Page 16数量1.克隆的目可用于各种文库的建立，比如人类基因组计划。2.克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。3.克隆载体可以使目的基因在宿主中低成本便捷的扩增4.表达载体的目的多样化的用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。质量1.克隆载体便于稳定保存目的基因2.克隆载体上有很多合适的酶切位点供选用3.克隆载体提供验证，如测序的方法 Page 17 一般的策略：将目
10、的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。T/A 克隆载体可以直接克隆 PCR 产物，省去了两端加装识别位点的设计，可直接连接克隆载体。已知序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的，这样做实际上是为了实验结果的严谨。Page 18 PCR PCR常见问题分析常见问题分析实验常见问题及注意事项实验常见问题及注意事项酶切问题分析酶切问题分析 连接注意事项连接注意事项 结果鉴定结果鉴定Page 19无扩增产物无扩增产物 非特异性扩增非特异性扩增 拖尾拖尾 假阳性假阳性 PCR PCR常见问题分
11、析常见问题分析Page 20无扩增产物无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解4.4.反应条件：退火温度太高，延反应条件：退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原因原因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新
12、引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；Page 21 非 特 异 性 扩非 特 异 性 扩增增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。Page 221.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数
13、过多 原因原因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢式重新设计引物或者使用巢式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用二阶适当提高退火温度或使用二阶段温度法段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 Page 23 拖尾拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈SmearSmear（弥散）状态。（弥散）状态。M 1 2Page 241.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPd
14、NTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原因原因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的浓度和镁离子的浓度6.6.减少循环次数减少循环次数Page 25 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心
15、轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。Page 26PCRPCR产物纯化产物纯化PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化
16、。Page 27确定DNA浓度：1）marker说明上是否有标明条带的DNA浓度，如果有，那么根据电泳的条带亮度与marker亮度对比去估计DNA浓度2）用分光光度计去测A260nm的OD值。如果测量OD值的话，你只要得到插入片段和载体的OD值比例关系就行了，因为具体计算的时候考虑的也只是比例而不是实际浓度。（载体片段和插入片段进行电泳的时候，能够看到清晰的条带。）酶切问题分析酶切问题分析Page 28连接重要的注意事项：1.载体总量2.载体和插入片段比例3.载体和插入片段质量。测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低 载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10。连接注意事项连接注意事项
