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1、植物病原真菌侵染过程的组织病理学观察一、目的要求学习组织整体透明染色技术和荧光染色技术,观察病菌在组织中的扩展过程和主要组织病理学特点,以增强学生对病原真菌侵染过程的了解。二、基本原理病原真菌侵染过程的组织病理学观察常用组织整体透明染色技术和荧光染色技术。组织整体透明的常用方法包括水合氯醛透明、甘油乳酸液水合氯醛透明、乳酸透明和毗咤透明等方法。1 .水合氯醒透明将小块组织在等量的酒精(95%)和冰醋酸混合液中固定24h,然后浸在饱和的水合氯醛水溶液中。待组织透明后取出用水洗净,经稀苯胺蓝的水溶液染色后，用甘油浮载镜检。2 .甘油乳酸液水合氯醛透明将小块标本或切片放在酒精和冰醋酸的混合液中固定彳
2、寺叶绿素褪去后,标本移在载玻片上；加含有1%酸性品红的甘油乳酸液几滴染色,徐徐加热到发烟为止。然后,除去残余的甘油乳酸液,加几滴不含染料的甘油孔酸液(并加热),洗去多余的染料,移在水合氯醛的饱和溶液中,组织透明后即可检视。如要永久保存,可以用水合氯醛的饱和溶液作浮载剂,用贴金胶水或磁漆等封固。3 .乳酸透明病组织在乳酸(75%)中浸几天后即透明,组织中有颜色的菌丝体和子实体都可以看到。病菌结构如果是无色的,可用加0.5%L0%苯胶蓝的甘油乳酸液染色中检视。4 .口比咤透明小块叶片浸在此碇中,很快即可褪色和透明,经过水洗或者直接放在甘油乳酸液中检视。组织整体透明染色技术常用于在组织和细胞水平观察
3、病菌的扩展过程。该法适于进行组织中病菌菌丝扩展的定量研究,可以揭示寄主和病原物相互作用的时空变化动态。但该法难以区分细胞的病理性坏死和机械创伤。荧光染色技术则能克服这一缺点,能更准确、快速地观察组织中病菌菌丝的扩展情况。组织荧光染色技术是研究病菌与其寄主之间相互关系的较为理想的方法。三、材料、试剂与仪器1.小麦品种和锈菌菌种供试品种由锈菌生理小种鉴别品种中或当地栽培品种中选取。试验菌种可以是小麦三种锈菌（秤锈菌、叶锈菌、条锈菌）中的任何一种。供试生理小种应能使各供试品种分别表现0,L2,34等各级反应型。用所选小种的新鲜夏泡子作接种体。2仪器与用具小花盆、毛笔、手持喷雾器、保湿筒（箱）,单刃刀
4、片、银子、烧杯（5Oml）、滴瓶、酒精灯、三角架、石棉网、载玻片、盖玻片、测微尺、普通显微镜、荧光显微镜等。3.试剂50%和95%乙醇、棉蓝乳酚液（乳酚油配方为：乳酸20mL苯酚20ml、20%甘油40ml、蒸储水20ml。乳酚油中加入0.050.1%棉蓝）、25%和50%甘油液、水合氯醛、滑石粉、甲醇、氯仿、Tris-HCl缓冲液（pH8.5,0.lmol/L）、固定透明液（乳酚油:95%乙醇=1:2）、NaOH（0.5molL）xcalcofluorwhite（0.1%）等。四、实验步骤一组织整体透明染色观察1.植物材料培育和接种供试小麦品种饱满种子播于小花盆中,在1620C和日照1216
5、h的条件下育苗。幼苗第1叶片展平后接种。接种叶片用手指蘸水轻抹去叶表面的蜡粉（去蜡）,用手指蘸取条锈菌新鲜夏泡子涂抹在叶片上接种,然后用手持喷雾器向接种叶片上喷水雾。再将花盆移入盛水的保湿筒内保湿1224h后取出,培育。618。6光照16h,光强不低于10000lx）o2,取样和处理分别在接种后12h、24h、72h和96h取样。每次每品种摘取3个接种叶片,用单刃刀片将接种叶片切成2cm长的叶段,叶段的上表皮朝上,从顶部由左下方向右上方斜切成楔形,以便于透明,染色后区分叶片上、下表面。将叶段置入95%乙醇和棉蓝乳酚液等量混合液中,在酒精灯上加热煮沸L5min,然后在室温下静置48h;取出叶段用
6、蒸储水漂洗2次；将洗涤后的叶段置入水合氯醛饱和溶液（一般按5g水合氯醛加2ml蒸储水的比例）中3050miW也可长时间放置）或用小火加热数分钝但勿使溶液沸腾。取出叶段用清水漂洗后置于载玻片上，用50%甘油液作浮载剂制片。3.样片检查和记载样片用显微镜镜检并进行显微计测。各品种每次取样的材料至少检查30个单个夏泡子侵入形成的侵染点。检查和记载的项目有：Q）吸器母细胞。统计各侵染点中吸器母细胞数目,计算平均数。（2）菌落线性长度。用测微尺测定菌落线性长度,该长度指菌落两端最远处的侵染菌丝顶端之间的直线距离。若小菌落只在一侧产生侵染菌丝,则计测由气孔下囊至最长菌丝顶端间的直线距离。若不用测微尺测量很
7、（J可以气孔长度为单位,估计菌落线性长度相当于气孔长度的倍数。4反应型记载各品种均保留部分接种苗,在接种后1214d,已充分发病,反应型正常时,按常规分级标准,记载反应型级别。（二）荧光染色观察1 .接种将锈菌夏泡子与滑石粉按1：10比例混匀,用毛笔将抱子粉涂抹于未脱蜡的麦叶表皮上,然后按常规方法保湿24ho2 .取样经保湿后即可取样,具体时间因观察内容而定。Q）将所取叶片切成2cm的叶段放入甲醇-氯仿（1:2）透明液中,放置6h。（2）转入固定透明液（乳酚油:95%乙醇=1:2）中煮沸1.5min,放置过夜。用50%乙醇冲洗2次每次15min,然后用蒸储水冲洗23次。（4）转入0.5mol/
8、LNaOH中漂白透明2次,再用蒸储水迅速冲洗23次。在TriS-HCl缓冲液（PH8.5z0.1mol/L）中浸泡30mino用0.1%CaICofIUOrwhi-te（增白剂）（溶于Tris-HCI缓冲液,pH8.5z0.1mol/L）将叶段染色5min,迅速转入蒸僧水,并冲洗4次,每次IOmino（7）转入25%甘油液中,浸30mino3 .镜检用含少量乳酚油的甘油作浮载剂制片观察。镜检时,荧光显微镜的激发滤光片应为365m（或u激发）,阻碍滤光片应为475nm,在此条件下,可清楚地进行观察。五、实验作业与思考1.列表比较各供试品种在接种后不同时间，单个侵染点的吸器母细胞数目、菌落线性长度、侵染点百分率的增长情况。2 .绘制各供试品种的典型侵染点形态图。3 .整体透明染色法有哪些优缺点？六、实验学时：1学时。
