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1、目目 录录一、概一、概 述述 二、试验准备二、试验准备三、试验步骤三、试验步骤 四、再验证周期四、再验证周期概 述一、概述一、概述1、试验目的试验目的：用微生物侵入试验对冻干粉针剂车间轧盖密封系统进行挑战性试验，以确认轧盖后容器密封系统的完好性。2、试验概述试验概述：取西林瓶灌装入已灭菌培养基，在正常生产线上抽真空、压塞、轧盖。此后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出并检查是否有微生物侵入，以确认容器密封系统的完好性。同时，须做阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。试验准备试验准备试验准备洗 瓶胶塞处理培养基菌悬液二、试验准备二、试验准备 批量：1000瓶/批1、洗瓶、洗瓶:清洗西林瓶
2、1100只，经305干热灭菌12分钟后送至灌装间备用。2、胶塞处理、胶塞处理:清洗胶塞1100只，经121 湿热灭菌20分钟后备用。3.1 预先对配制、灌装系统按照冻干粉针剂无菌操 作要求进行清洁、灭菌。3.2 按照培养基生产厂商要求，每批按 TSB（胰 酪胨大豆肉汤培养基）32.3g，加1L注射用水 的比例进行配制，加热溶解并标定至4.5L，置 于灭菌柜中用纯蒸 汽121灭菌20min。二、试验准备二、试验准备 3、配制培养基、配制培养基:二、试验准备二、试验准备 3.3将灭菌后的培养基（TSB配制液）通过 未装滤膜及滤芯的过滤系统，在灌装机 的数控器上调节好装量（3.5ml）进行灌 装半加
3、塞。3.4将灌装半加塞的培养基在百级层流保护下转移至冻干机内抽真空，结束后全压塞、出箱、轧盖。4、制备微生物菌悬液：、制备微生物菌悬液：4.1从铜绿假单胞菌（ATCC 9027）的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含6ml无菌培养基的试管中，在3035下培养1824h。4.2将每管的培养物分别转入含600ml相同培养基的容器内，于3035下培养1824h。在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊。4.3在微生物侵入试验开始时，所用菌悬液浓度（活菌数）必须达到1106CFU/ml。二、试验准备二、试验准备 试验步骤试验步骤n营养试验n微生物侵入试验微生物侵入试验n阳性对照实验n微生物侵入试验后
4、 营养试验三、试验步骤三、试验步骤1.1从1000瓶培养基中取150瓶作为本次试验的试样品。1.2用剪刀轻轻从斜侧面去除至少50瓶试样品的整个铝盖（注意不要破坏其密封口，将去铝盖时不慎损坏容器密封性的所有试样品剔除），另取80瓶带盖试样品，将每一试样品倒转，使培养基与西林瓶内表面及胶塞充分接触，在3035竖立倒置培养14天。1、试验样品的制备试验样品的制备:三、试验步骤三、试验步骤1.3在培养期内，当试验中发现任何在培养期内，当试验中发现任何带盖带盖试样品试样品长菌时，则试验无效，须弃去全部试样品，长菌时，则试验无效，须弃去全部试样品，重新从头开始试验。重新从头开始试验。2.1所有试样品培养1
5、4天均不长菌时，从上述1.2 试样品中随机取20个带盖试样品，每个试样 品内接种100CFU铜绿假单胞菌。在3035 下培养7天，或培养至所有试样品都呈阳性结 果。三、试验步骤三、试验步骤2、确认培养基促菌生长能力、确认培养基促菌生长能力营养试验营养试验：2.1.1若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样品中，微生物生长良好，则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。使用革兰染色后，并置于紫外灯下，培养基呈蓝绿色荧光，则确认试样品容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌，即为阳性。2.1.2若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样品中，微生物生长条件不好或经鉴别后受其它菌种污染，则试验失败，需重新作营养试验。
6、三、试验步骤三、试验步骤3、微生物侵入试验操作步骤、微生物侵入试验操作步骤:微生物培养及侵入试验应在不影响生产微生物培养及侵入试验应在不影响生产环境的地方（中心化验室阳性室）进行。环境的地方（中心化验室阳性室）进行。三、试验步骤三、试验步骤3.1 将新鲜的铜绿假单胞菌（ATCC 9027）的 菌悬液倒入适当的容器内，用试管架固定 试样品。三、试验步骤三、试验步骤3.2 从上述1.2试样品中再取50只带盖试样品为 A组，另取25个去盖 试样品为B组，均倒 置于菌悬液中,使试样容器内的培养基充 分接触封口内表面，试样品的颈部及封口 的外表面应完全浸泡在菌悬液中（如下图 1所示）。图图1微生物挑战试
7、验示意图微生物挑战试验示意图三、试验步骤三、试验步骤3.3将A组和B组试样品在菌悬液中持续浸泡约4h后，取出试样品，擦干试样品容器外残余的菌悬液，其外表用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒五分钟（注意不要破坏其密封口）。三、试验步骤三、试验步骤3.4从1.2试样品中另取有盖和去盖的培养基各两 个，做阳性对照。阳性对照试样品不经菌悬 液浸泡，其外表用含0.5%过乙酸的70%异丙 醇消毒五分钟后，接种10100CFU铜绿假单 胞菌，按营养试验的步骤进行阳性对照试验。3.5将消毒后的试样品放入塑料袋中，置3035下培养7天。检查试样品内微生物生长情况，有生长记作“”，无生长记作“”。三、试验步骤三、
8、试验步骤3.5.1如果试样品长菌，则按照2.1所述方法确认生 长菌是挑战微生物铜绿假单胞菌。3.5.2 如果所有试样品均不长菌，则从浸过菌悬液的A组试样中取10甁，B组试样中取5瓶，按2.所述方法对试样品进行营养性试验。三、试验步骤三、试验步骤3.6微生物侵入试验用菌悬液经灭菌后丢弃。4.1步骤2、3.4中进行的营养试验和3.5.2中进行的阳性对照试验都合格，微生物侵入试验才有效。三、试验步骤三、试验步骤4、结果评价、结果评价:4.2挑战试验中A组和B组如有长菌，需记录长菌的试样数。在A组中如出现长菌，则须按下述要求作进一步调查。4.2.1仔细去除微生物生长的容器的盖和塞，检查容器封口是否有缺损，造成微生物侵入。4.2.2将观察到试样品封口的缺陷，采用拍照或其他适当方式详细记录。三、试验步骤三、试验步骤 4.3如果任何挑战试验中长菌的试样品不是由于容器封口明显的物理性缺损所致，容器密封性挑战试验作失败论。三、试验步骤三、试验步骤5、贮存稳定性、贮存稳定性:5.1将剩余未经挑战试验的容器放入箱中，保存在室温黑暗处；5.2在适当的时间间隔（如12个月、24个月）取出一些容器，重复挑战性试验（步骤同上）。三、试验步骤三、试验步骤再验证周期再验证周期四、再验证周期四、再验证周期1、当轧盖设备发生变化时应进行再验证;2、改变胶塞、西林瓶及铝盖尺寸、材质 时应进行再验证。
