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1、啤酒发酵酵母扩培学习资料啤酒厂取得接种酵母的方式有三种方式，其优缺点见图2.1:图2.1啤酒取得醉母的方式和其优缺点第一节纯种酵母的哺育一、哺育啤酒纯种酵母工艺原理酵母是一种兼性微生物，这就是说，细胞的新陈代谢和繁衍即可以在有氧的状态下也可以在无氧的状态下进行。啤酒酵母菌的的繁衍进程分为四个阶段（见图2.7）:1 .迟缓期：在此期间，虽有营养物质存在，但酵母大体不繁衍；2 .对数生长期：此期间酵母繁衍最为迅速；3 .稳按期：此时，代谢产物CO,和酒精的积累使酵母繁衍逐渐变慢，活菌数最高；4 .衰亡期：营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，酵母菌死亡率增加，活菌数减少。酵母哺育中，最重要的阶段是对
2、数生长期，此时的营养、氧气供给及其他条件如：酵母细胞浓度和温度都必需达到最佳。酵母由于不断地消耗氧气，必需持续通入足够的无菌空气。因为氧气缺乏时，其中一部份酵母会进行发酵，从而产生CO,和酒精，而不是产生新细胞，这样生成的有活力的细胞数就减少了。二、啤酒纯种酵母的分离哺育啤酒酵母的分离哺育就是利用特殊的分离技术，将优良强壮的单细胞酵母从原菌中分离出来，加以扩大哺育，供生产利用。分离哺育的方式不少，工厂往往利用的是平板分离法或者划线分离法。取得原菌的方式：(1)从实验室保留的原菌种中分离，原菌种必需先通过几回哺育活化的再行分离；(2)从生产中的酵母泥或者主发酵液中分离。1 .平板分离哺育法(又称
3、稀释分离法，见图2.2)这种方式简单易行，适合于工厂现场利用。先将盛有麦汁的琼脂试管哺育基放在热水中融化，冷却至4245,再将准备分离培育的酵母原菌用白金针移植到已融化的哺育基内。如分离哺育发酵液的酵母，则先使之静置，倾出上部清液，留少量发酵液，混合均匀后接种。如分离哺育酵母泥，需加少量无无菌水或者麦汁，稀释后再接种。将分离哺育的酵母移植于融化的哺育基内后，充分振荡，使混合均匀，用白金针从该试管挑少量移植到第2支试管中，随即将第1支试管中的哺育基倾注在已灭菌的哺育皿中，均匀扩散在哺育皿底面，使之凝固。用一样方式再从第2支试管移植到第3支，而后第4支试管内，别离将取样后的哺育基倾注在哺育皿内，如
4、图所示。然后，将哺育皿置2527保温箱中哺育23天，天天检查菌落生长情况，剔除形态上有改变的菌落，选择菌落形态正常、细胞大小均匀的菌落进行哺育。必要时应进行23次重复分离。缗殖培养 前液图2.2平板分离培养法2 .划线分离哺育法此法和平板分离法的按照是相似的，各有长处。划线法简单，速度较快；平板法在平板上分离的菌落单一均匀，取得纯种的机率略高。用接种针挑取适当稀释的菌液，直接在已灭菌的平面皿哺育基上划线(图2.3),在第3或者第4划线区可能取得单一菌落。然后将所需要的菌落移植到斜面哺育基上，以待进一步检查。这个方式普通用于分离纯化生产上已有的菌种。33图2.3划线分离哺育法1, 2,3,4-别
5、离表示第1,2,3,4次划线区3 .林德奈氏单细胞分离哺育法（小滴哺育法，见图2.4）此法是由汉生氏单细胞分离哺育法演变而来的。将准备分离哺育的酵母或者发酵液，移植到已灭菌的麦汁哺育基中，经多次稀释至每1滴麦汁仅含1个细胞为止。在无菌室顶用白金针取稀释液滴在盖玻片上，或者凹形载玻片孔内，可滴35排，每排35个小点，点要均匀，距离要一致。将盖玻片翻过来，使有小滴的一面面向凹形载玻片的孔穴，穴内加1滴无菌水，盖玻片和载玻片间用凡士林密封。在显微镜下检查每一个小滴，将惟独1个细胞的小滴位置记下，如图所示。将检片置2527哺育箱内，哺育23天，天天检查酵母细胞生长情况。小滴哺育每次应做3个以上的检片，
6、通过哺育后，加以选择。挑选发育正常的菌落，用灭菌的三角形滤纸，把菌落吸出。移植到已灭菌的麦汁中，扩大哺育，经生理特性鉴定后供生产利用。图24林德奈氏小滴哺育法第二节啤酒酵母的实验室扩培啤酒酵母纯正与否，对啤酒发酵和啤酒质量的影响很大。啤酒生产企业利用的酵母由保留的纯种酵母，通过扩大哺育，达到必然数量后，供生产现场利用。每一个啤酒厂都应保留适合本厂利用的纯种酵母，以保证生产的啤酒具有稳定的风格和特性。啤酒酵母扩大哺育的顺序如下：斜面试管（原菌种）一富氏瓶或者试管哺育一巴氏瓶或者三角瓶哺育一卡氏罐哺育一汉生罐哺育一酵母扩大哺育罐一酵母繁衍罐一发酵罐。以上从斜面试管到卡氏罐哺育为实验室扩大哺育阶段；
7、汉生罐以后为生产现场扩大培育阶段。实验室扩大哺育酵母的顺序：4 .斜面试管普通是啤酒工厂保藏的纯粹原菌或者由科学研究机构和菌种保藏单位供给。5 .富氏瓶哺育富氏瓶内盛麦汁IOm1,灭菌后备用。将种酵母用白金针或者巴氏滴管接种于富氏瓶内,在2527C保温箱中哺育23天，天天按时摇动，使沉淀的酵母从头扩散到哺育基中。同一种酵母每次哺育24瓶，扩大时加以选择。6 .巴氏瓶哺育取500100Oml的巴氏瓶，加入250500ml麦汁，加热煮沸，使瓶内蒸汽从侧管喷出，30分钟后，吸出弯曲管内的凝结水，塞上棉花塞，冷却备用。在无菌室内，将试管中的酵母液由侧管接种入巴氏瓶内中，在25保温箱中哺育2天，天天检查
8、哺育情况。为了使啤酒酵母能逐渐适应低温环境，可将哺育温度适当调节到20摆布，但哺育时间要略长一些。巴氏瓶也可用大三角瓶或者平底烧瓶代替。7 .卡氏哺育罐实验室酵母扩培普通是利用装5ml麦汁的容器，将酵母菌接种于此容器中。酵母繁衍分几回进行，把处于高泡阶段的哺育液倒入大约10倍的容器中。为保证酵母良好快速的生长繁衍，普通扩培倍数不超过10倍。实验室酵母扩培通常截止到不锈钢卡氏罐，这是与生产现场扩培的连接环节。通常所用容器体积及麦汁接种量见表2.1。卡氏罐的容量：小卡氏罐810L,大卡氏罐2025L.表2.1扩培容器容积与接种麦汁量图2.5卡氏罐容器代号123容器体积/ml101001000无菌麦
9、汁量/ml550500接种量/ml555总量/ml555555(1)卡氏罐的外形结构(见图2.5)空气过滤器2紧箍把3绝缘手柄4-取样阀5一带橡皮膜的接种头(2)卡氏罐哺育酵母的操作工艺流程(见图2.6)卡氏罐有3个紧箍使其密封，卡氏罐普通都带有绝缘手柄、无菌空气过滤器和取样阀。在卡氏罐内注入麦汁，其量约为总容量的5080%,将卡氏罐和麦汁一路加热煮沸灭菌，然后放置于冰箱或者冷房间内冷却至接种温度备用。在加热灭菌时，先拔去侧管的棉塞，使蒸汽从侧管和弯曲管喷出30min,住手加热，然后塞上棉塞，吸去弯曲管内的冷凝水。麦汁中增添IL无菌水，以补充水分的蒸发。大多数卡氏罐都有带橡皮膜的接种头，在无菌
10、条件下通过接头利用注射器接种。接入酵母时，接种量为100200ml。通过取样阀上的无菌空气接头，使无菌空气通过垂直升液管从底部进入麦汁以增进酵母繁衍。若已达到期望的酵母细胞数，则将通过空气过滤机的紧缩空气压入，酵母菌液从垂直液管和取样阀被压出，送入汉生罐。利用后，卡氏罐必需拆开用清洗剂进行人工清洗，并于利用前检查过滤器是不是清洁和完好。卡氏罐普通接入12个巴氏瓶的酵母液，摇动混合均匀后，置于1520C下保温35天，即可进行扩大哺育，或者可供约100L麦汁发酵用。普通情况下，卡氏罐的最大工作压力为0.2MPa。(3)卡氏罐的长处麦汁杀菌可利用杀菌锅，也可利用燃气炉或者电热炉代替；适于麦汁通氧；给
11、酵母转移提供了安全的条件；较易清洗；运输方便。麦汁量大时，不能在实验室进行酵母扩培，因为送输很艰难。因此，需要在车间的酵母扩培设备中继续进行扩大哺育。加热图2.6卡氏罐酵母培养流程8 .实验室扩大哺育的技术要求(D一切哺育用具必需彻底刷洗干净，塞好棉塞，干热灭菌，灭菌温度170摆布；(2)哺育用的哺育基，应利用现场加酒花的麦汁，加热煮沸并加蛋白澄清，利用蒸汽间歇灭菌后，在25C保温箱中贮存23天，证明无污染后，方可利用；(3)每次扩大稀释倍数约10倍以下；(4)每次移植接种后，要镜检酵母细胞的发育情况；(5)随着每阶段的扩大哺育，哺育温度慢慢降低，以适应现场发酵情况；(6)每一个扩大哺育阶段，
12、均应做平行哺育：试管45只，巴氏瓶23个，卡氏罐2个，选择优者进行扩大哺育。第三节啤酒酵母的车间扩培卡氏罐哺育后，酵母进入现场扩大哺育。酵母扩大繁衍的方式可按照工厂具体条件进行。啤酒厂普通都有汉生(Hansen)罐哺育设备，可持续利用1株酵母，反复多次扩培而不需换种，直至酵母浮现衰退和染菌等异样情况。酵母生理状态与扩培工艺之间的关系见图2.7o图27酵母生理状态与扩培工艺之间的关系一、开放式酵母扩培生产规模较小的啤酒厂普通不配置专用的酵母纯种扩培设备，有的往往直接从大啤酒厂购买酵母泥。以这种方式进行生产，虽然启动生产很方便，但由于容器卫生和运输问题，实际上很难保证酵母的卫生和质量。在这种情况下
13、，啤酒厂可自行实施酵母的简易扩培。1 .传统的开放式酵母扩培方式(见图2.8)其工作方式与实验室的扩培大致相同。从试管到小三角瓶，再从小三角瓶到4X5L的大三角瓶，酵母数量慢慢扩大。最后用带盖的、容量约200L的金属容器进行扩培，然后进入生产，在较小的发酵池中继续增殖和发酵，其参数见表2.2。表2.2发酵池体积与接种酵母液量图2.8传统开放式酵母扩培采用这种方式进行扩培，人们很方便地就可以够将酵母哺育液扩大化至5吨。从试管到三角瓶的酵母哺育要利用无菌麦汁，以后的哺育进程则全数利用生产麦汁。2 .小罐式酵母扩培方式这种扩培方式是，酵母在一个容量为40L、且容易清洗的金属罐中增殖哺育。按照生产规模
14、，也可利用多个罐。但其中一个必需作为原种罐，用于下一次扩培。此种方式简单、方便，是一种很实用的酵母扩培方式。工作方式如下(见图2.9):图2.9罐式酵母扩培1-40L罐中接种25L嫩啤酒2纯种培养池将一个罐彻底清洗干净，用蒸汽灭菌，然后接入20L经高温灭菌的无酒花麦汁，在大约20的温度下，酵母很快增殖，并形成丰硕的泡沫。这时，把罐中的酵母哺育液别离加入到此外4个已注入20L冷却麦汁的罐中，通过大约24天的哺育后，各个罐中的酵母培育液已达到高泡阶段。这时，应及时将3个罐中的酵母哺育液(约60L)倒入已彻底清洗灭菌的纯种哺育池中。第四个罐中的酵母哺育液则用于下一批次的扩培接种。此进程可在一按时间内
15、重复进行。二、密闭式酵母扩培方式最近几年来的现代化酵母扩培设备都是在汉生罐的基础上加以改良的，它由不同规格的密闭式不锈钢容器组成的，扩大哺育在密闭系统中进行，直至达到发酵罐所需的酵母添加量。由于企业实际情况不同，酵母扩培的要求也不尽相同，其设备及扩培方式也浮现了许形式，本书主要介绍典型的汉生罐哺育法、一罐法、两罐法和持续增殖法。1 .汉生罐哺育法汉生罐哺育系统由1个麦汁杀菌罐和12个酵母哺育罐组成，容积为2()03()0L,各罐都具有夹套，可以进行杀菌、冷却和保温，罐上装有手摇搅拌器或者以通风搅拌。啤酒厂普遍应用的汉生罐酵母扩培工艺方式如下:斜面MOml试管一=*50ml三角瓶培养=500ml三角瓶培养300Ond三角瓶培养25C23C211917C15L卡氏罐培养25OL汉生罐培养100oi增殖罐培养400OL扩大罐培养15,CC119实验室按510倍扩大哺育，现场按34倍转接，哺育到对数生长期结束前23小时为止，出芽率为7585%。操作流程：(1)在无菌条件下，用无菌空气将卡氏罐中的酵
