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1、文件修改记录版本修订次数修订日期修订内容002011-02-01A12012-05-25修订分发号：（仅适用于控制文件）（仅盖有红色印章的文件才有效）1.0目的规定菌落总数的测定方法。2.0范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁、原辅材料、流程卫生中菌落总数的检测。3.0术语3.1菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。4.1 职责质检部：负责按此方法对加多宝凉茶、浓缩汁、原辅材料、流程卫生中菌落总数进行检测。4.2 工作流程图见附录A6.O内容及要求6.1 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如
2、下：6.1.1 恒温培养箱：361、551（必要时可选用）6.1.2冰箱：2一5C6.1.3恒温水浴锅：4616.1.4天平：感量O.Ig6.1.5pH计6.1.6无菌吸管：Iml（具0.01刻度）、5ml（具0.05刻度）、IOml（具0.1刻度）。6.1.7无菌锥形瓶：容量250ml、500ml6.1.8无菌试管：18200mm6.1.9无菌培养皿：直径90mm6.1.10放大镜6.2培养基和试剂6.2.1平板计数琼脂培养基。6.2.275%乙醇溶液。6.3操作步骤6.3.1样品的稀释6.3.1.1固体和半固体样晶：称取25g样晶置盛有225mL生理盐水的无菌均质杯内，8000r/minI
3、oOoOr/min均质1min2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min,制成1:10的样品匀液。6.3.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.3.L3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.3.1.4按6.3.L3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一
4、次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。6.3.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样晶匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.3.1.6及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基（可放置于46ClC恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.3.2培养6.3.2.1待琼脂凝固后将平板翻转，36C1培养48h+2或55C1培养48h2。6.3.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层
5、琼脂培养基（约4mL）,凝固后翻转平板，按6.3.2.1条件进行培养。6.3.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）表示。6.3.3.1选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算
6、半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.3.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。6.3.4结果与报告6.3.4.1菌落总数的计算方法6.3.4.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。6.3.4.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=C（n1+0.ln2）d（1）式中：N样品中菌落数；EG-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2-第二稀释度（高稀释倍数）平板个数
7、；d稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数232,24433,35N=C/（n1+0.ln2）d=（232+244+33+35）/（2+0.12）XlO2=544/0.022=24727上述数据按6.3.4.2.2数字修约后，表示为25000或2.5X10。6.3.4.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。6.3.4.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6.3.4.1.5若所有
8、稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。6.3.4.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU-300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6.3.4.2菌落总数的报告6.3.4.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。6.3.4.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。6.3.4.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。6.3.4.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。6. 3.4.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。7. 0相关文件无8. 0质量记录8.1KJWIF-QA-34成品检测记录8.2KJWTF-QA-33成品微生物检验报告附录A：菌落总数检验程序
