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1、药学院生物制药教研室药学院生物制药教研室第六章第六章 酶工程制药酶工程制药第五节第五节 酶工程的研究现状酶工程的研究现状一、酶基因工程生产酶一、酶基因工程生产酶二、突变酶二、突变酶三、进化酶三、进化酶四、抗体酶四、抗体酶人工模拟酶人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。
2、是为了解决酶的以上缺点。制备选择性聚合物的过程制备选择性聚合物的过程(a)(a)在印迹分子和交联剂存在下在印迹分子和交联剂存在下通过光和热启动集合作用通过光和热启动集合作用(b)(b)形成聚合物形成聚合物(c)(c)研磨聚合物研磨聚合物(d)(d)抽提印迹分子抽提印迹分子(e)(e)得到选择性聚合物得到选择性聚合物MIPMIPM-M-单体单体;CR-;CR-交联剂交联剂;P-;P-印迹分子印迹分子五、酶的化学修饰五、酶的化学修饰酶在实际应用中有局限性：酶在实际应用中有局限性：作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解；被识别降解；酶蛋白经
3、不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活；半衰期短、易变性失活；酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。一、酶化学修饰赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝甘异缬组丝二、化学修饰的方法二、化学修饰的方法化学修饰方法的化学修饰方法的几个问题几个问题对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等；件及侧链基团性质等；选择修饰剂考虑选择修饰剂考虑：1 1）分子
4、量、修饰剂链长和对蛋白）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；吸附性；2 2）修饰剂上反应基团的数目及位置；）修饰剂上反应基团的数目及位置；3 3）修）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；反应活性基团）；选择酶反应条件要注意选择酶反应条件要注意：1 1）反应体系的溶剂性质、）反应体系的溶剂性质、盐浓度、盐浓度、PHPH、温度、时间；、温度、时间；2 2）酶与修饰剂的比例。）酶与修饰剂的比例。最常用的修饰剂最常用的修饰剂PEGPEG类类
5、修饰修饰聚乙二醇聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)(polyethyleneglycol,PEG)通常没有免疫通常没有免疫原性和毒性原性和毒性,不会破坏生物分子的活性，其生物相容性不会破坏生物分子的活性，其生物相容性已通过美国食品和药物管理局已通过美国食品和药物管理局(FDA)(FDA)认证。认证。酶蛋白侧链基团的常用修饰酶蛋白侧链基团的常用修饰赖氨酸氨基的烷基化（卤代乙酸等）；赖氨酸氨基的烷基化（卤代乙酸等）；具有两个临位羰基的化合物修饰精氨酸胍基（丁二酮具有两个临位羰基的化合物修饰精氨酸胍基（丁二酮等）；等）；烷基化试剂修饰巯基；烷基化试剂修饰巯基；碘代乙酸修饰组氨酸
6、咪唑基；碘代乙酸修饰组氨酸咪唑基；还有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族还有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族羟基等；羟基等；二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰氨基的化学修饰氨基的化学修饰羧基的化学修饰羧基的化学修饰 应用较多的修饰方法应用较多的修饰方法 1.1.酶的表面化学修饰酶的表面化学修饰 (1)(1)大分子修饰：可溶性大分子，其中相对分子量在大分子修饰：可溶性大分子，其中相对分子量在500-20000500-20000范范围内的围内的PEGPEG类修饰剂应用最广，既能溶于水，又溶于大多数的有类修饰剂应用最广，既能溶于水，又溶于大多数的有机溶剂，化学修饰时多采用单甲氧基聚乙
7、二醇（机溶剂，化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG)MPEG)(2)(2)小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已经被广位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已经被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，邻苯二酸酐等。邻苯二酸酐等。(3)(3)交联修饰：使用双功能基团试剂如戊二醛，交联修饰：使用双功能基团试剂如戊二醛，PEGPEG等将酶蛋白等将酶蛋白分子之间，亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，分
8、子之间，亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并可提高其稳定性，增加了酶在非可使酶分子活性结构加固，并可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。水溶液中的使用价值。(4)(4)固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境的改变，会使酶的性接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境的改变，会使酶的性质（最适质（最适phph，最适温度，稳定性等）改变。，最适温度，稳定性等）改变。2.2.酶分子内部修饰酶分子内部修饰3.3.结合定点突变的化学修饰结合定点突变的化学修饰三、修饰酶的
9、特性三、修饰酶的特性四、酶化学修饰的应用四、酶化学修饰的应用酶经过化学修饰后会产生的变化：酶经过化学修饰后会产生的变化：1.1.提高生物活性；提高生物活性；2.2.增强在不良环境中的稳定性；增强在不良环境中的稳定性；3.3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；原性；4.4.产生新的催化能力；产生新的催化能力；在医药方面：在医药方面：克服酶在体内的不稳定性克服酶在体内的不稳定性 消除或降低酶的抗原性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到达并集中于病灶细胞有助于酶分子到达并集中于病灶细胞在酶结构功能研究中：在酶结构功能研究中：研究酶空间结构与功能的关系
10、，如酶的活性中心研究；研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的功能；测定酶分子中某种氨基酸的数量测定酶分子中某种氨基酸的数量在工业领域：在工业领域：化学修饰酶能够提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性，改变酶化学修饰酶能够提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适的底物专一性和最适phph等酶学性质。等酶学性质。酶蛋白化学修饰的局限性酶蛋白化学修饰的局限性1.1.专一性是相对的专一性是相对的2.2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变3.3.只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行只能在具有极性的氨
11、基酸残基侧链上进行4.4.因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。确性和系统性。第六节 酶工程在制药工业中的应用3132固定化酶产品介绍氨基酰化酶氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种化酶，可以用于生产各种L-L-氨基酸药物。氨基酸药物。19691969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用得到的氨基酰化酶，用DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶为载体通葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将过离子键结合法制成固
12、定化酶，将L-L-乙酰氨基酸水乙酰氨基酸水解生成解生成L-L-氨基酸，用来拆分氨基酸，用来拆分DL-DL-乙酰氨基酸，连续乙酰氨基酸，连续生产生产L-L-氨基酸。剩余的氨基酸。剩余的D-D-乙酰氨基酸经过消旋化，乙酰氨基酸经过消旋化，生成生成DL-DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的用游离酶生产成本的6060左右。左右。33固定化酶法生产固定化酶法生产L-L-氨基酸氨基酸乙酰乙酰-DL-DLAla Ala L LAla+Ala+乙酰乙酰-D-DAlaAlaAminoacylaseAminoacylase氨基酰化酶氨基酰化酶34泵泵储罐反应
13、产物离离心心机机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子固定化酶柱子DEAE-葡聚糖葡聚糖氨基酰化酶氨基酰化酶晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala35(2)(2)天门冬氨酸酶天门冬氨酸酶：19731973年日本用聚丙烯酰胺凝胶年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产生产，将延胡索酸转化生产L-L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。19781978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，年以后，改用角叉菜胶
14、为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。业化生产。36(3)(3)天门冬氨酸脱羧酶天门冬氨酸脱羧酶：将含天门冬氨酸脱羧酶的：将含天门冬氨酸脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸脱羧酶，于氨酸脱羧酶，于19821982年用于工业化生产，催化年用于工业化生产，催化L-L-天门冬氨酸脱去羧基，生产天门冬氨酸脱去羧基，生产L-L-丙氨酸。丙氨酸。37(4)(4)青霉素酰化酶：青霉素酰化酶：
15、是在药物生产中广泛应用的一是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。种固定化酶。可用多种方法固定化。19731973年已用年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pHpH等条等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6 6一一氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6(6一一APA)APA)或或7 7一氨基头孢霉烷酸一氨基头孢霉烷酸(7(7一一ACA)ACA)，也可以催化，也可以催化6 6一一APAAPA或或7 7
16、一一ACAACA与其他的羧酸与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。的青霉素或头孢霉素。38固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸青霉素酰化酶与抗生素改造青霉素酰化酶与抗生素改造394041 E.Coli E.Coli 斜面斜面 细胞细胞 固定化细胞固定化细胞 青霉素青霉素G G 转化液转化液 滤液滤液 6-APA 6-APA 粗品粗品培养培养固定固定转化转化过滤过滤抽提抽提1.1.技术路线技术路线42青霉素酰化酶转化流程图青霉素酰化酶转化流程图思考题思考题1.1.核酶？核酶？2.2.抗体酶及其制备方法？抗体酶及其制备方法？
