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1、 酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的分离纯化和动力学分析分离纯化和动力学分析概概 述述n酶在物质代谢及调节中的重要意义；酶在物质代谢及调节中的重要意义；n常用的酶蛋白分离纯化方法；常用的酶蛋白分离纯化方法；n酶类检测在临床生化检验中的意义；酶类检测在临床生化检验中的意义；n酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。目目 的的 要要 求求1.巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；2.掌握酶的分离纯化方法；掌握酶的分离纯化方法；3.掌握酸性磷酸酶（掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因素；活性测定的原理、方法
2、和影响因素；4.熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。试剂与器材试剂与器材一、一、ACP的分离纯化试剂：见实验的分离纯化试剂：见实验教材教材P31；二、二、ACP动力学分析试剂：见实验动力学分析试剂：见实验教材教材P35；三、三、器材：普通离心机，器材：普通离心机，721分光光分光光度计，恒温水浴箱，研钵等。度计，恒温水浴箱，研钵等。实实 验验 内内 容容一、一、ACP的分离纯化的分离纯化二、二、ACP的比活性分析的比活性分析三、三、ACP的动力学分析的动力学分析 1.时间进程（时间进程（t-V）曲线）曲线 2.酶浓度酶浓度-速度（速度（E-V）曲线）曲线 3
3、.pH-酶活性酶活性（pH-V）曲线）曲线 4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲线）曲线 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-V）曲线）曲线一、一、ACP的分离纯化的分离纯化 1.概况：概况：ACP分布广泛分布广泛 分子量分子量100kD 最适最适pH5.0 热稳定性较好热稳定性较好 溶解度较高溶解度较高 临床应用广临床应用广2.ACP的分离纯化方法的分离纯化方法 根据根据ACP的理化性质，可以用层析、电的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。泳、透析等多种方法分离纯化。本实验采用分级离心本实验采用分级离心+分段盐析法：分段盐析法：ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度与其
4、它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以次逐步离心分离；不同，以次逐步离心分离；ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在在70C仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。沉淀和分段盐析。3.ACP分离纯化的步骤流程分离纯化的步骤流程 小麦胚芽小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水冷蒸馏水 滤滤 液液研碎，研碎，4层纱布过滤层纱布过滤3500rpm，10min离心离心 上清液上清液 I4000rpm，10min离心离心1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清液 I 上清液上清液 II（激活并稳定（激活并稳定ACP，
5、沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白）缓慢搅拌缓慢搅拌4000rpm，8min离心离心 上清液上清液5000rpm，10min离心离心饱和硫酸铵饱和硫酸铵 54ml/100ml上清液上清液 II 上清液上清液 II（溶解（溶解ACP，沉沉淀杂蛋白）淀杂蛋白）4000rpm，8min离心离心 上清液上清液 III70C水浴水浴2min冷水浴冷水浴3min饱和硫酸铵饱和硫酸铵 51ml/100ml上清液上清液 II 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（沉淀沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌缓慢搅拌缓慢搅拌4000rpm，10min离心离心约约1/3上清液上清液 III蒸馏水，蒸馏水，溶解，洗涤溶解，洗涤（溶解（溶解AC
6、P，沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白）4000rpm，10min离心离心 上清液上清液 IV 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（沉淀沉淀ACP）EDTA9ml，饱和硫酸铵，饱和硫酸铵10ml/100ml上清液上清液 IV，2倍体积预冷甲醇倍体积预冷甲醇 沉沉 淀淀（酶纯化物）（酶纯化物）4000rpm，10min离心离心蒸馏水溶解，洗涤蒸馏水溶解，洗涤 上清液上清液 V（酶液）（酶液）缓慢搅拌缓慢搅拌 1.各各上清液中蛋白质含量测定上清液中蛋白质含量测定 原理：染料结合比色法原理：染料结合比色法CBBG-250，max=595nm；步骤：标准曲线制作步骤：标准曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，进
7、各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。行重复实验，减少随机误差。二、二、ACP的比活性分析的比活性分析 2.各各上清液中上清液中ACP活性测定活性测定 酚酚-4-AAP显色法显色法:以磷酸苯二钠为底物，由以磷酸苯二钠为底物，由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4-AAP缩合最终生成红色醌类化合物，缩合最终生成红色醌类化合物，max=510 nm；注意：显色过程中两种缓冲液：注意：显色过程中两种缓冲液：柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供，提供ACP反应条件反应条件 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件，提供成
8、色反应条件 3.各各上清液中上清液中ACP比活性分析比活性分析 ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚即酚即nmol/minml为为1个活性单位个活性单位；纯化倍数纯化倍数=各各上清液中上清液中ACP的比活性的比活性上清液上清液I 中中ACP的比活性的比活性比活性比活性=酶活性酶活性 U/ml蛋白质含量蛋白质含量mg/ml酶的回收率酶的回收率=各各上清液中上清液中ACP的活性的活性 总体积总体积上清液上清液I中中ACP的活性的活性 总体积总体积还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异
9、性。三、三、ACP的动力学分析的动力学分析 1.时间进程（时间进程（t-A）曲线）曲线AACP的的 t-A 曲线曲线时间（t）酚生成量2.酶浓度酶浓度-速度（速度（E-A）曲线）曲线 酶蛋白含量（E）反应速度VACP 的的 E-V 曲线曲线 3.pH-酶活性酶活性（pH-V）曲线）曲线pH反应速度V最适pHACP的的pH-酶活性曲线酶活性曲线1.影响方式：影响方式：当当S较低时，较低时，V随随S的的 增加呈正比例增加增加呈正比例增加 当当S较高时，较高时，V随随S的的 增加减慢增加减慢 当当S增大到某一值时，增大到某一值时，V 达到最大反应速度达到最大反应速度Vmax2.影响曲线：影响曲线：V
10、SVmax（矩形双曲线）（矩形双曲线）Km4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲线）曲线曲线方程曲线方程米米-曼氏方程曼氏方程（1）米）米-曼氏方程曼氏方程：V=VmaxSKm+SV：某一时刻的反应速度S：某一时刻的底物浓度Vmax：反应系统能够达到的最大反应速度Km：米氏常数 Km和和Vmax的测定：的测定：双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得 1 1 1V Vmax S Vmax=+1V 1S纵截距=KmKmVmax斜率=Vmax1横截距=1Km-1.抑制剂的概念：抑制剂的概念：抑制剂（抑制剂（inhibitor）：）：能使酶的催化活性下降而能使酶
11、的催化活性下降而 不引起酶蛋白变性的物质不引起酶蛋白变性的物质2.抑制作用的分类：抑制作用的分类：抑制作用抑制作用不可逆性抑制不可逆性抑制可逆性抑制可逆性抑制竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-A）曲线）曲线 竞争性抑制的动力学变化竞争性抑制的动力学变化米米-曼氏方程变化为曼氏方程变化为：V=VmaxSKm（1+I/Ki）+S此时，Km增大，增大，Vmax不变不变1/V1/SE +I EIKi无抑制剂有抑制剂KH2PO4对对ACP 的的抑制分析分析1/V1/S无抑制剂有抑制剂分析抑制类型KH2PO4对对ACP 的的抑制作用作用实实 验验 安安 排排1.实验分组实验分组2.实验时间安排实验时间安排3.实验内容选择与分工实验内容选择与分工4.实验报告书写实验报告书写
