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1、第二节 基因工程的原理和技术问题：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？1 获得人的获得人的胰岛素胰岛素基因基因 目的基因的获取目的基因的获取2 将目的基因转移入大肠杆菌将目的基因转移入大肠杆菌（1）将）将人的人的胰岛素胰岛素基因基因拼接到大肠杆菌的质粒中拼接到大肠杆菌的质粒中 形成重组形成重组DNA分子分子（2）将重组质粒导入到大肠杆菌中？将重组质粒导入到大肠杆菌中？将将重组重组DNA分子分子导入受体细胞导入受体细胞（3）人的）人的胰岛素胰岛素基因导入成功了吗？基因导入成功了吗？筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞3 大肠杆菌能合成人的大肠杆菌能合成人的胰岛素胰岛素 目的基因的表达
2、目的基因的表达获取获取重组重组导入导入检测检测表达表达一、目的基因的获取一、目的基因的获取（获得人的（获得人的胰岛素胰岛素基因）基因）DNADNA的粗提取的粗提取1、从基因文库中获取目的基因：、从基因文库中获取目的基因：(通常在未知通常在未知DNADNA序列的情况下序列的情况下)基因组文库的构建：基因组文库的构建：cDNAcDNA文库的建立：文库的建立：包含该生物的所有基因。：包含该生物的所有基因。：包含该生物的部分基因。：包含该生物的部分基因。一般针对基因的编码区而建立。一般针对基因的编码区而建立。2、体外直接合成目的基因、体外直接合成目的基因 (通常在已知通常在已知DNADNA序列的情况下
3、序列的情况下)利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因变性变性退火退火延伸延伸A PCRA PCR全称为全称为_。C C 条件：条件：_、_ _、_ _、_。B B 原理：原理：_D D 结果：结果：_聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA复制复制已知序列的目的基因已知序列的目的基因四种脱氧核苷酸三磷酸四种脱氧核苷酸三磷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶使目的基因短时间内呈指数方式扩增使目的基因短时间内呈指数方式扩增E E 过程：过程：_高温变性、低温退火、中温延伸高温变性、低温退火、中温延伸由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列序列利用利用DNA
4、合成仪化学合成合成仪化学合成 合成较小的基因（不超过几十个碱基）合成较小的基因（不超过几十个碱基）例：核酸分子杂交的探针，例：核酸分子杂交的探针，PCRPCR扩增的引物等。扩增的引物等。DNADNA合成仪合成仪利用利用DNA合成仪化学合成合成仪化学合成运载体运载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组运载体重组运载体运载体自连运载体自连目的基因自连目的基因自连AATTC G目的基因目的基因AATTC GGCTTAAGCTTAAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG二、形成重组二、形成重组DNADNA分子分子（将人的将人的胰岛素胰岛素基因拼接
5、到大肠杆菌的基因拼接到大肠杆菌的质粒中）质粒中）重组重组DNADNA分子一定能使目的基因表达吗？分子一定能使目的基因表达吗？重组重组DNA分子的组成：分子的组成：目的基因、标记基因、目的基因、标记基因、启动子、终止子、复启动子、终止子、复制原点制原点 参与的工具酶：参与的工具酶：限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶连接酶二、形成重组二、形成重组DNADNA分子分子三、三、将重组将重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞 （将重组质粒导入到大肠杆菌中）将重组质粒导入到大肠杆菌中）导入微生物细胞：用导入微生物细胞：用CaCa2+2+处理受体细胞，将处理受体细胞，将重组重组DNADNA与
6、之混合；与之混合；导入植物细胞：导入植物细胞：土壤农杆菌转化法、基因枪土壤农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等法、花粉管通道法等导入动物细胞：导入动物细胞：对受精卵进行显微注射、胚对受精卵进行显微注射、胚胎干细胞技术、精子载体法等胎干细胞技术、精子载体法等土壤农杆菌法土壤农杆菌法花粉管通道法花粉管通道法基因枪法基因枪法例：用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物细胞，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过培养形成愈伤组织，最后发育成转基因植物。目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞如：显微注射法如：显微注射法动物细胞受精卵显微注射法动物细胞受精卵显微注射法例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心
7、脏病的药物tPA。同样方法可获得疫苗、生长激素等。四、筛选含有目的基因的受体细胞四、筛选含有目的基因的受体细胞 （人的胰岛素基因导入成功了吗）（人的胰岛素基因导入成功了吗）DNADNA分子杂交技术：分子杂交技术：抗药性筛选法：抗药性筛选法：互补显色筛选法：原核互补显色筛选法：原核营养缺陷性筛选法：营养缺陷性筛选法：载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营养缺陷。物质。两者构成营养缺陷。在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存在缺少营养物质的培养基上受
8、体细胞不存活，存活的是导入成功的受体细胞。活的是导入成功的受体细胞。五、目的基因的表达五、目的基因的表达（大肠杆菌能合成人的胰岛素吗）大肠杆菌能合成人的胰岛素吗）1 1、分子水平检测：、分子水平检测：检测转基因生物的检测转基因生物的DNA是否插入目的基因是否插入目的基因（即检测导入是否成功）（即检测导入是否成功）检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质：检测目的基因是否翻译成蛋白质：提取蛋白质、抗原提取蛋白质、抗原-抗体杂交抗体杂交2 2、个体水平检测：、个体水平检测：检测性状检测性状 总结：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1获得目的基因（和质粒载体）；2形成重组质粒；3制备感受态细胞（Ca2+），用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。
