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1、2023-9-271第二章 发酵的流程菌种扩大培养2023-9-272 第一节 发酵的特点及流程 一、发酵的特点一、发酵的特点发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下：1、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。2、发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。2023-9-273 3、发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可
2、以得到较为单的代谢产物。4、由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。5、发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。6、微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。2023-9-2747、工业发酵与其他工
3、业相比，投资少，见效快，可以取得显著的经济效益。基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。2023-9-275二、发酵过程的组成部分二、发酵过程的组成部分1、发酵过程的组成除某些转化过程外，典型的发酵过程可以划分成六个基本组成部分：（1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定；（2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；（3）培养
4、有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长；（5）产物萃取和精制；（6）过程中排出的废弃物的处理。六个部分之间的关系如图所示。在建立发酵过程以前，首先要分离出产生菌，并改良菌种，使所产生的产物符合工业要求。2023-9-2762023-9-2773、发酵生产的条件（1）某种适宜的微生物（2）保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧pH等）（3）进行微生物发酵的设备（4）提取菌体或代谢产物，精制成产品的方法和设备 2023-9-278第二节第二节 生产菌种的扩大培养生产菌种的扩大培养 发酵罐容积几百立方米。生产用种子是一个由实验
5、室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；营养、温度、需氧等条件要求均有所不同。种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。2023-9-279 种子扩大培养种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。发酵工业生产过程中的种子的必须满足
6、以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理性状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。2023-9-2710在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段 2023-9-2711一、实验室种子的制备一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可用液体培养法。2023-9-27
7、12（一）孢子的制备1、细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富。培养温度一般为37。细菌菌体培养时间12d，产芽孢的细菌培养510d。2、霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528。培养时间一般为414d。3、放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无机盐等。培养温度一般为28。培养时间514d。2023-9-2713（二）液体种子制备1、好氧培养对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）可以用摇瓶
8、液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管三角瓶摇床种子罐 2、厌氧培养酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）其种子的制备过程如下：试管三角瓶卡式罐种子罐2023-9-2714 例如例如:生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g葡萄糖和20g琼脂于1L水中）的斜面上，于4冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培养2-3d。再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培养2d.
9、移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20培养3-5d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。2023-9-2715二、生产车间种子制备二、生产车间种子制备 种子罐的培养基因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，需氧菌，还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布。1、种子罐的作用使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。2、种子罐级数的确定 种子罐级数种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养
10、的次数，取决于：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。2023-9-2716 比如：细菌细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27,40h孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27，1024h，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐放线菌放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 2023-9-27173、确定种子罐级数需注意的问题（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的
11、生产率，增加染菌机会（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。2023-9-2718第三节第三节 种子质量的控制种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制一、影响孢子质量的因素及控制影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。1、培养基种子质量不稳定的主要原因是原材料质量波动。例如：在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响不同。原材料质量的波动，也
12、会影响孢子质量。如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。2023-9-2719 水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。解决措施解决措施：（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；（2）严格控制灭菌后培养基的质量；（3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；（4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。2023-9-27202、培养条件（1）温度
13、如土霉素生产菌种在高于37培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般要严格控制孢子子斜面的培养温度。（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子数量和质量有较大影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现：气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。2023-9-2721表2-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响相对湿度（%）斜面外观活孢子计数（亿/支）16.5192536404
14、5上部稀薄下部稠略黄上部薄中部均匀发白一片白，孢子丰富，稍皱1.22.35.72023-9-27223、培养时间和冷藏时间（1）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。解决措施解决措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。（2）冷藏时间斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4d左右即于4冰箱保存，发现冷藏78d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。2023-9-2723 冷藏时间对孢子生产能力也有影响。例如在链霉素
15、生产中，斜面孢子在6冷藏两个月后发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。4、接种量 接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。也影响到菌种的适应期。2023-9-2724二、影响种子质量的因素及控制生产过程中影响种子质量的因素通常有：孢子的质量、培养基、培养条件、种龄、接种量。1、培养基种子培养基要满足以下要求：（1）营养成分适合种子培养的需要（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；（3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高（5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2023-9-27252、培养条件（1）温度
16、（2）通气量在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。2023-9-27263、种龄种龄种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。2023-9-27274、接种量接种量接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入
