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1、 内容内容l色谱法基本知识色谱法基本知识l高效液相色谱相关内容高效液相色谱相关内容l影响分离的因素影响分离的因素l实验前准备工作实验前准备工作l主要分析步骤主要分析步骤 一、色谱分析法一、色谱分析法起源起源基本概念基本概念分类分类起源起源:19061906年俄国植物学家米哈伊尔年俄国植物学家米哈伊尔茨维特茨维特 色谱分离法色谱分离法 又称层析法，层又称层析法，层离法等，是一种现代的物理化离法等，是一种现代的物理化学分离、分析方法，广泛应用学分离、分析方法，广泛应用于化学、医药、生化、环保等于化学、医药、生化、环保等领域，它既可用于混合物的分领域，它既可用于混合物的分离和样品纯度的检查，又可用离
2、和样品纯度的检查，又可用于对化合物的定性和定量分析。于对化合物的定性和定量分析。分离分离植物植物色素色素基本概念基本概念l基线：色谱柱中只有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。它反映基线：色谱柱中只有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。它反映检测器本底的高低。检测器本底的高低。l噪声：由未知的偶然因素引起的基线起伏现象。噪声：由未知的偶然因素引起的基线起伏现象。l峰宽：通过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的距离。峰宽：通过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的距离。l保留时间：从进样点到色谱峰的顶峰的时间。保留时间：从进样点到色谱峰的顶峰的时间。l死时间：流动相通过色谱系统的时间。在死时间
3、：流动相通过色谱系统的时间。在HPLCHPLC中为溶剂峰前沿出现的时中为溶剂峰前沿出现的时间。间。l死体积：进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间。死体积：进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间。l色谱峰：流出曲线上的突起部分。色谱峰：流出曲线上的突起部分。l分配系数（分配系数（K K）：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。）：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。K K与组分、固定相、流动相及温度有关。与组分、固定相、流动相及温度有关。l容量因子（容量因子（k k）：也叫分配容量、容量比及质量分配系数等，是达到分）：也叫分配容量、容量比及质量分配系数等，是达到分配平衡后
4、，组分在固定相的量与流动相中的量之比。配平衡后，组分在固定相的量与流动相中的量之比。基本概念基本概念l基线漂移：基线漂移：是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间（0.5-1.0h0.5-1.0h）内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系）内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系统有关。统有关。l线性范围：当注入最小至最大进样量时，检测器响应处于与进样量线性范围：当注入最小至最大进样量时，检测器响应处于与进样量成正比的范围。成正比的范围。l检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的检测器的池体积：它应小于最早流出的
5、死时间色谱峰的洗脱体积的1/101/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。，否则会产生严重的柱外谱带扩展。l灵敏度：也叫响应值，指一定量的物质通过检测器时所给出的信号灵敏度：也叫响应值，指一定量的物质通过检测器时所给出的信号大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有考虑噪声，其高低变化大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有考虑噪声，其高低变化并不能严格表示检测器的检测能力。并不能严格表示检测器的检测能力。l检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生可辨别的信号时检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生可辨别的信号时（一般信噪比（一般信噪比2），），在单位体积或单位时间内需向检测器送入的在单位体
6、积或单位时间内需向检测器送入的样品量。它考虑了噪声，是全面衡量检测器性能的重要指标。检测样品量。它考虑了噪声，是全面衡量检测器性能的重要指标。检测限越小，仪器性能越好。限越小，仪器性能越好。色谱法分类色谱法分类按分离的机理可分为：按分离的机理可分为：l吸附色谱：是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能吸附色谱：是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差别而使混合物得以分离。的差别而使混合物得以分离。l分配色谱：是利用不同组分在固定相与流动相间的分配色谱：是利用不同组分在固定相与流动相间的分配系数（或溶解度）不同而使混合物得以分离。分配系数（或溶解度）不同而使混合物得以分离。l离子交换色谱：是利用不同组分
7、对离子交换剂亲和离子交换色谱：是利用不同组分对离子交换剂亲和力不同而使混合物得以分离。力不同而使混合物得以分离。l凝胶色谱凝胶色谱(排阻色谱排阻色谱)：是利用凝胶对不同组分因分：是利用凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同使混合物得以分离。子大小不同而阻滞作用不同使混合物得以分离。l亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。色谱法分类色谱法分类按操作形式可分为：按操作形式可分为：l薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。l纸色谱：分配色谱。纸色谱：分配色谱。l柱色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶柱色谱。柱色谱：吸附、分
8、配、离子交换、凝胶柱色谱。按流动相状态的不同，可分为：按流动相状态的不同，可分为：l气相色谱法气相色谱法 (GC)(GC)l液相色谱法液相色谱法 (LC)(LC)l超临界流体色谱超临界流体色谱 (SFC)(SFC)二、高效液相色谱相关内容二、高效液相色谱相关内容l特点特点l研究对象研究对象l高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪展示l高效液相色谱仪工作流程高效液相色谱仪工作流程l高效液相色谱仪结构高效液相色谱仪结构l高效液相色谱法分类高效液相色谱法分类1 HPLC1 HPLC特点特点高效液相色谱法是高效液相色谱法是2020世纪世纪6060年代后期发展起来的一种年代后期发展起来的一种新颖、快速的分离分
9、析技术。新颖、快速的分离分析技术。l高高 压：压：压力可达（压力可达（1.52-3.04)1.52-3.04)10104 4 kPa kPa。l高高 速：速：所需的分析时间一般少于所需的分析时间一般少于1h1h。l高高 效：效：一根柱子可以分离一根柱子可以分离100 100 种以上的组分。种以上的组分。l高灵敏度：高灵敏度：用微升数量级的试样可进行分析。用微升数量级的试样可进行分析。l流动相选择范围广：流动相选择范围广：大部分的有机溶剂以及水大部分的有机溶剂以及水 和有机溶剂的混合物均可用。和有机溶剂的混合物均可用。经典色谱法2 2 研究对象研究对象l高沸点化合物；高沸点化合物；l难挥发及热不
10、稳定的化合物；难挥发及热不稳定的化合物；l离子型化合物及高聚物等。离子型化合物及高聚物等。色谱仪分类色谱仪分类液相色谱仪液相色谱仪气相色谱仪气相色谱仪分析用色谱仪分析用色谱仪制备用色谱仪制备用色谱仪流程色谱仪流程色谱仪液液色谱仪液液色谱仪液固色谱仪液固色谱仪气液色谱仪气液色谱仪气固色谱仪气固色谱仪排阻色谱排阻色谱吸附色谱吸附色谱离子色谱离子色谱超临界液体色谱超临界液体色谱分配色谱分配色谱3 3 高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪展示3 3 高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪展示3 3 高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪展示3 3 高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪展示3 3 高效液相色谱仪展示高效液相
11、色谱仪展示l贮液器中的流动相被高压泵打入贮液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中组分在两相中具有不同的分配系具有不同的分配系数。数。在两相中作相对运动时，经在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附过反复多次的吸附-解吸的分配解吸的分配过程，各组分在过程，各组分在移动速度上产生移动速度上产生较大的差别，较大的差别，被分离成单个组分被分离成单个组分依次从柱内流出。通过检测器时，依次从柱内流出。通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送
12、到样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出记录仪，数据以图谱形式打印出来。来。4 4 高效液相色谱仪工作流程高效液相色谱仪工作流程5 5 高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的结构l高压输液系统高压输液系统l进样系统进样系统l分离系统分离系统l检测系统检测系统l色谱数据处理系统色谱数据处理系统高压输液系统高压输液系统包括：包括：l流动相贮存器流动相贮存器l高压输液泵（核心部件）高压输液泵（核心部件）:能提供能提供150-450kg/cm150-450kg/cm2 2的压强；流速的压强；流速稳定，流量可以调节；应符合：密封性好、输出流量恒定、压力稳定，流量可以调节；应符合：密封性好
13、、输出流量恒定、压力平稳、可调范围宽、便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。平稳、可调范围宽、便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。l过滤器过滤器l梯度洗脱装置梯度洗脱装置 :可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以提高分离效果，缩短分离时间。程序连续改变组成，以提高分离效果，缩短分离时间。高压输液系统高压输液系统泵的保养泵的保养l 使用流动相尽量要清洁；使用流动相尽量要清洁；l 进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；l 流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀；l 避免泵内堵塞或有气泡。避免泵内堵塞或有气泡。进样系统
14、进样系统l注射器进样注射器进样l高压定量进样阀高压定量进样阀泵泵排放排放进样进样柱柱泵泵柱柱进样进样排放排放5 5 高效液相色谱仪部件高效液相色谱仪部件 进样方式与用量进样方式与用量l六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的7575，并且要求每次进样体积准确、相同；并且要求每次进样体积准确、相同；l使用完全装液法进样时，使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的进样量最少为定量环体积的3 3至至5 5倍，倍，这样才能完全置换样品定量环内
15、残留的溶液，达到所这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。要求的精密度及重现性。六通阀使用和维护注意事项：六通阀使用和维护注意事项：l样品样品溶液进样前必须溶液进样前必须用用0.450.45m m滤膜过滤滤膜过滤，以，以减少微粒对进样阀的磨损减少微粒对进样阀的磨损。l转动阀芯时不能太慢转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过过高的压力将使柱头损坏高的压力将使柱头损坏。l为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，
16、每次为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。分析结束后应冲洗进样阀。分离系统分离系统l色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。l柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。其他金属。金属管用得较多。l一般备有一个前置柱（预柱）。一般备有一个前置柱（预柱）。l柱子装填得好坏对柱效影响很大。柱子装填得好坏对柱效影响很大。l发展趋势是发展趋势是:减小填料粒度和柱径以提高柱效。减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱子形状柱子形状l色谱柱一般长色谱柱一般长5 530cm30cm，内径，内径4 45mm5mm，凝胶色谱柱内，凝胶色谱柱内径径3 312mm12mm，制备柱内径较大，可达，制备柱内径较大，可达25mm25mm以上。以上。5cm10cm15cm40cm色谱柱的保养色谱柱的保养 对硅胶基键合相填料，对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的水溶液流动相的pHpH值不得超出值不得超出2-8.52-8.5范围范围(eg(eg：C C1
