高美华医学免疫学补体结合实验.ppt
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1、50%溶血试验(溶血试验(50%complement hemolysis,CH50)测定血清总补体)测定血清总补体活性活性 一、实验原理一、实验原理 补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血,溶血抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血,溶血程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的量依赖呈一特殊的S形曲线,该曲线在形曲线,该曲线在30%70%之间最陡,几乎呈直线,即此阶段之间最陡,几乎呈直线,即此阶段对补体量的变化非常敏感,因此实验常以对补体量的变化非常敏感,因此实验常以50%溶
2、血作为判断终点来测定血清总补体活性,这溶血作为判断终点来测定血清总补体活性,这一方法称为补体一方法称为补体50%溶血实验(溶血实验(CH50)。)。二、试剂二、试剂1、绵羊红细胞(、绵羊红细胞(SRBC):无菌采静脉血,除去纤维蛋):无菌采静脉血,除去纤维蛋白后,洗涤配成白后,洗涤配成2%浓度应用。浓度应用。2、溶血素:抗绵羊红细胞抗体,需提纯后灭活补体。用、溶血素:抗绵羊红细胞抗体,需提纯后灭活补体。用稀释缓冲液稀释至稀释缓冲液稀释至2单位。单位。3、稀释缓冲液:、稀释缓冲液:PH7.4巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 三、方法方法1、待检标本的处理:、待检标本的处理:取试管一支加待测血清取试管一支
3、加待测血清0.20ml,加入,加入3.80ml pH7.4巴巴比妥缓冲液,使血清为比妥缓冲液,使血清为1:20稀释。稀释。2、取、取1列列10支试管,从支试管,从110编号,第编号,第19为测定管,第为测定管,第10管为对照管。按表进行加样。管为对照管。按表进行加样。3、50%溶血标准管溶血标准管 全溶管:全溶管:2%SRBC 1ml+4ml蒸馏水混匀静置蒸馏水混匀静置10min 50%溶血管:溶血管:2ml全溶管液体全溶管液体+2ml pH7.4巴比妥缓冲巴比妥缓冲液。液。4、上述所有试管经、上述所有试管经2500rpm,离心,离心5min后,与后,与50%溶溶血管肉眼初步比较,取较接近的血
4、管肉眼初步比较,取较接近的2管进行比色,确定管进行比色,确定最接近最接近50%溶血管的管号。溶血管的管号。四、结果判断:四、结果判断:根据最接近根据最接近50%溶血管的管号,查出该管所加待溶血管的管号,查出该管所加待检血清标本量,按下列公式计算:检血清标本量,按下列公式计算:CH50(U/ml)=1/50%溶血管的血清用量(溶血管的血清用量(ml)稀释倍数稀释倍数正常范围:正常范围:50100 U/ml 补体结合试验补体结合试验(complement fixation test,CFT)一、原理一、原理 Ag和相应和相应Ab反应所形成的免疫复合物(反应所形成的免疫复合物(IC)能吸)能吸附(固
5、定)并激活补体。附(固定)并激活补体。5种成份分属于:反应系统;种成份分属于:反应系统;补体系统;指示系统。补体系统;指示系统。反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应系统,优先结合补体。若反应系统中待测的系统,优先结合补体。若反应系统中待测的Ab(或(或Ag)与已知与已知Ag(或(或Ab)相对应,则)相对应,则Ag与与Ab形成形成IC后可结后可结合补体;再加入指示系统时,因已没有游离的补体而合补体;再加入指示系统时,因已没有游离的补体而不出现溶血,为补体结合试验阳性。若不相对应,将不出现溶血,为补体结合试验阳性。若不相对应,将会有游离的补体参与指示
6、系统的反应,最终会出现溶会有游离的补体参与指示系统的反应,最终会出现溶血现象,为阴性。血现象,为阴性。补体结合试验图示补体结合试验图示受检系统受检系统指示系统指示系统溶血反应溶血反应补体结合试验补体结合试验1、仅有抗原或抗体、仅有抗原或抗体补体补体红细胞红细胞溶血素溶血素阳性阳性阴性阴性2、抗原抗体反应、抗原抗体反应红细胞红细胞溶血素溶血素阴性阴性阳性阳性抗原抗体补体补体抗原抗原/抗体抗体二、试剂二、试剂1、受检抗原、抗血清(、受检抗原、抗血清(56 30min灭活,灭活,1:50稀释)。稀释)。2、补体(豚鼠新鲜血清,补体(豚鼠新鲜血清,2u)、)、1%绵羊红细绵羊红细胞(胞(SRBC)、)
7、、溶血素(溶血素(2u)。)。3、生理盐水、试管、吸管、水浴、生理盐水、试管、吸管、水浴箱等。箱等。三、方法三、方法1、溶血素效价的滴定、溶血素效价的滴定按照下表操作按照下表操作以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效价。价。在补体结合试验时,溶血素的效价也称之为在补体结合试验时,溶血素的效价也称之为1个个溶血素单位,在正式试验时一般采用溶血素单位,在正式试验时一般采用2个溶血素个溶血素单位。单位。管管 溶血素溶血素 2 单位单位 pH 7.4巴巴 2羊羊 号号 稀释度稀释度溶血素溶血素补补 体体 比妥缓冲比妥缓冲红细胞红细胞假定结果假定结果 1 1
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